DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食管癌易感性及放療后損傷和生存關(guān)系的研究.pdf

1、我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，在中國十大惡性腫瘤死亡率中，食管癌死亡率居第四位。我國90％以上為鱗狀細(xì)胞癌。放射性治療是食管癌的主要治療手段之一，但食管癌預(yù)后差，中晚期患者治療后5年生存率不足20％。雖然研究表明吸煙、飲酒過度、肥胖和營養(yǎng)缺乏都可能引起食管癌，然而，即使暴露于相同環(huán)境因素的人群中也只有少部分個(gè)體罹患食管癌。另外，臨床中也常常發(fā)現(xiàn)即便是相同的病理類型和分期的患者接受相同的治療方案后，其治療后副作用及生存率均存

2、在巨大的差異。上述情況提示個(gè)體的遺傳因素可能在食管癌易感性、治療效果和預(yù)后等方面起著重要的作用。
　　內(nèi)在因素或外在環(huán)境因素中各類理化、生物致癌因子均可對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷，以致引起DNA結(jié)構(gòu)和序列的改變，增加增殖性細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性。在人體細(xì)胞內(nèi)，DNA損傷可以通過DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)來修復(fù)，修復(fù)能力的不足可以增加個(gè)體罹患食管癌的危險(xiǎn)度，影響治療效果和預(yù)后。目前認(rèn)為，不同個(gè)體DNA修復(fù)能力的差異是由遺傳決定的，可能是DNA修復(fù)通

3、路中某些核心基因的多個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)的綜合作用引起的。
　　目前關(guān)于DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食管癌易感性、治療效果和預(yù)后關(guān)系的研究體現(xiàn)了以下幾個(gè)方面的特點(diǎn):1）樣本量小(＜1000例)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析把握度不夠，結(jié)果重復(fù)性差;2）較少考慮基因-環(huán)境交互作用;3）用來闡明基因多態(tài)性可能的生物學(xué)機(jī)制的功能學(xué)研究匱乏;4）臨床轉(zhuǎn)化研究較少。
　　基于以上認(rèn)識(shí)，我們的研究以＞1000例中國漢族人群食管鱗癌患者和＞1

4、000例與之匹配的無腫瘤病史的正常人為研究對(duì)象，采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究方法、候選基因和功能性位點(diǎn)為主的SNP選擇策略，篩選了DNA修復(fù)通路中6個(gè)代表性基因(XPC，ERCC2，ERCC5，F(xiàn)EN1，hOGG1和NEIL1)的12個(gè)功能性SNP位點(diǎn)，Taqman基因型檢測(cè)技術(shù)，探討DNA修復(fù)基因SNP與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系及可能存在的基因-環(huán)境交互作用。并在此基礎(chǔ)上，通過檢測(cè)細(xì)胞和癌旁組織中不同基因型相關(guān)的mRNA表達(dá)水平，

5、從體內(nèi)外水平探尋DNA修復(fù)基因功能性SNP可能的生物學(xué)機(jī)制。最后，在187例僅接受根治性放療或放化療的食管鱗癌患者中，采用病例-病例研究方法，用Taqman基因型檢測(cè)技術(shù)對(duì)DNA修復(fù)通路中6個(gè)候選基因(XRCC1，F(xiàn)EN1，hOGG1，NEIL1，RAD51和WRN)的12個(gè)功能性SNP進(jìn)行基因型分型，探討DNA修復(fù)基因SNP位點(diǎn)與食管癌放療后急性放射性肺炎、急性放射性食管炎和總生存期的關(guān)系。
　　本研究為揭示DNA修復(fù)基因SNP

6、和食管癌易感性及可能的生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)，也為今后食管癌的個(gè)體化預(yù)防和診治提供重要參考。
　　第一部分 DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食管癌易感性的關(guān)聯(lián)研究及功能探討
　　目的:DNA修復(fù)基因在食管癌的發(fā)生過程中起著重要的作用，其功能性SNP位點(diǎn)可能通過改變DNA損傷修復(fù)的能力而影響個(gè)體罹患食管癌的易感性。我們對(duì)DNA修復(fù)基因功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，探尋它們與食管癌易感性的關(guān)系，同時(shí)探討其可能的生物學(xué)機(jī)制。
　　

7、材料與方法:我們以1126例食管鱗癌患者和1131例年齡、性別匹配的健康對(duì)照為研究對(duì)象，采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究方法，候選基因和功能性位點(diǎn)為主的SNP選擇策略篩選了6個(gè)DNA修復(fù)基因(XPC，ERCC2，ERCC5，F(xiàn)EN1，hOGG1和NEIL1)的12個(gè)功能性SNP位點(diǎn)，采用Taqman法進(jìn)行基因型分型，多元Logistic回歸模型和多因素降維(MDR)分析不同基因型的主效應(yīng)、聯(lián)合效應(yīng)和環(huán)境-基因交互作用，同時(shí)用假陽性報(bào)告率

8、(FPRP)檢驗(yàn)真實(shí)的關(guān)聯(lián)。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)?25例食管鱗癌癌旁組織標(biāo)本中檢測(cè)基因型相關(guān)的mRNA表達(dá)水平;同時(shí)從數(shù)據(jù)庫中下載了來源于4個(gè)種族270名正常人的基因型數(shù)據(jù)和相對(duì)應(yīng)的B淋巴母細(xì)胞系中基因mRNA表達(dá)水平，通過線性回歸模型趨勢(shì)檢驗(yàn)評(píng)估不同人群SNP基因型對(duì)mRNA表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:在單個(gè)位點(diǎn)分析中，3個(gè)基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)與食管鱗癌的發(fā)生顯著相關(guān)，分別是ERCC2 rs238406、ERCC5 rs22961

9、47和FEN1 rs4246215。在危險(xiǎn)型基因型聯(lián)合分析中，食管鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)隨著ERCC2、ERCC5危險(xiǎn)型基因型的數(shù)目增加而增加，呈現(xiàn)很好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)(Ptrend=0.007)。在分層分析中，ERCC2rs238406 TG/TT基因型攜帶者較GG基因型攜帶者，ERCC2≥1個(gè)危險(xiǎn)型基因型攜帶者較未攜帶危險(xiǎn)型基因型者，均顯著提高累計(jì)吸煙劑量＞16包年的個(gè)體食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，都達(dá)到了1.58倍，且同質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)層間差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)顯著性(P=0.036和P=0.050)。多元Logistic回歸模型和多因素降維(MDR)一致發(fā)現(xiàn)ERCC2rs238406變異基因型與累計(jì)吸煙劑量之間存在交互作用(P=0.018)。假陽性報(bào)告率(FPRP)檢驗(yàn)證實(shí)上述關(guān)聯(lián)是可信的。線性回歸模型趨勢(shì)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在B淋巴母細(xì)胞系中，ERCC2 rs238406等位基因G→T的改變影響ERCC2 mRNA表達(dá)水平，其趨勢(shì)在亞洲人群中達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)臨界值(Ptrend=0.098)，在歐洲人群中

11、達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(Ptrend=0.011)，但在中國漢族人群中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ptrend=0.960)，其它與食管癌易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)對(duì)mRNA表達(dá)水平均無影響。
　　結(jié)論:本研究是目前為數(shù)不多的探索DNA修復(fù)基因功能性SNP與食管癌易感性關(guān)聯(lián)性的大樣本病例-對(duì)照研究。結(jié)果進(jìn)一步支持DNA修復(fù)基因的遺傳變異與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，還需要更大的樣本及進(jìn)一步功能學(xué)研究去驗(yàn)證。
　　第二部分 DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食

12、管癌放療后損傷及生存關(guān)系研究
　　第一節(jié) DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食管癌放療后損傷的相關(guān)性研究
　　目的:DNA修復(fù)基因在輻射造成的DNA損傷修復(fù)中起著重要作用，其功能性SNP位點(diǎn)可能通過改變DNA損傷修復(fù)的能力而影響患者對(duì)放療的反應(yīng)性。我們對(duì)DNA修復(fù)基因功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分型，探尋DNA修復(fù)基因SNP位點(diǎn)與食管癌放療后急性放射性肺炎和急性放射性食管炎發(fā)生之間的相關(guān)性。
　　材料與方法:我們選擇于2008年

13、1月～2011年12月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行根治性放療或放化療的食管鱗癌患者。從DNA修復(fù)基因中選擇6個(gè)基因(XRCC1、hOGG1、FEN1、NEIL1、RAD51和WRN)的12個(gè)功能性SNP位點(diǎn)。治療前留取外周血標(biāo)本，Taqman方法進(jìn)行基因型分型。放射治療中及治療后評(píng)價(jià)急性放射性肺炎和食管炎發(fā)生情況(評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為CTCAE v4.0)，評(píng)價(jià)終點(diǎn)為≥2級(jí)急性放射性肺炎和≥2級(jí)急性放射性食管炎。采用Cox危害風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行相

14、關(guān)性的單因素和多因素分析，計(jì)算危害風(fēng)險(xiǎn)比及95％可信區(qū)間。
　　結(jié)果:共入選187例符合標(biāo)準(zhǔn)的食管鱗癌患者，其中男性138例，女性49例，中位年齡64歲。急性放射性肺炎和急性放射性食管炎發(fā)生的中位時(shí)間分別是放療開始后的第35天和第24天，共有28例患者(15.0％)發(fā)生了≥2級(jí)急性放射性肺炎，42例患者(22.5％)發(fā)生了≥2級(jí)急性放射性食管炎。V20被發(fā)現(xiàn)和≥2級(jí)急性放射性肺炎相關(guān)，年齡和LE50被發(fā)現(xiàn)和≥2級(jí)急性放射性食管炎相

15、關(guān)。攜帶有NEIL1rs4462560 GC/CC基因型的患者較GG基因型的攜帶者發(fā)生≥2級(jí)急性放射性肺炎的危害風(fēng)險(xiǎn)減低(校正后HR=0.39，95％ CI=0.16-0.95，P=0.037)。同樣的相關(guān)性也發(fā)生在≥2級(jí)急性放射性食管炎中(校正后HR=0.42，95％ CI=0.21-0.86，P=0.017)。
　　結(jié)論:NELL1基因的功能性SNP位點(diǎn)可能是食管癌放療后急性放射性肺炎和急性放射性食管炎發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，該結(jié)

16、果需要更大的樣本及功能學(xué)研究中去驗(yàn)證。
　　第二節(jié) DNA修復(fù)基因單核苷酸多態(tài)性和食管癌放療后生存的相關(guān)性研究
　　目的:DNA修復(fù)基因功能性SNP位點(diǎn)可能通過改變DNA損傷修復(fù)的能力而影響食管癌患者放療后生存情況。我們對(duì)DNA損傷修復(fù)基因功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，探尋DNA修復(fù)基因SNP位點(diǎn)與食管癌放療后總生存期之間的相關(guān)性。
　　材料與方法:我們選擇187例于2008年1月～2011年12月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)

17、院進(jìn)行根治性放療或放化療的食管鱗癌患者。用Taqman方法對(duì)DNA修復(fù)通路中6個(gè)基因(XRCC1、hOGG1、FEN1、NEIL1、RAD51和WRN)12個(gè)功能性SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型。評(píng)價(jià)終點(diǎn)為總生存期。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行基因型與總生存期相關(guān)性的單因素分析，用Log-rank法檢驗(yàn)兩組生存曲線差異是否有統(tǒng)計(jì)意義。采用Cox危害風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行相關(guān)性多因素分析。
　　結(jié)果:生存隨訪截止時(shí)間是2013年1月，97

18、例患者(55.1％)死亡，中位生存期為11個(gè)月，79例患者(44.9％)存活，中位生存期為27個(gè)月。1-，2-和-3年的總生存期分別是70.5，49.9和43.4％。腫瘤TNM分期和LGTV-P被發(fā)現(xiàn)和總生存期相關(guān)。攜帶WRN rs2725335 GA/GG基因型的患者較AA基因型攜帶者延長總生存期(校正后HR=0.43，95％ CI=0.22-0.86，P=0.017)。攜帶HOGG1 rs1052133 CC基因型的患者較GG基因型