人干擾素α-2b基因重組卡介苗的構(gòu)建及抗膀胱癌作用的研究.pdf

1、一、研究背景 膀胱移行細(xì)胞癌(Bladder transitional cell carcinoma,BTCC)是我國泌尿外科最常見的惡性腫瘤,雖約70﹪以上為淺表性腫瘤,但術(shù)后易復(fù)發(fā)、易進(jìn)展.卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)定期膀胱灌注是目前預(yù)防淺表性BTCC術(shù)后復(fù)發(fā)最有效的方法,在減少BTCC術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)數(shù)目、降低復(fù)發(fā)頻率等方面,BCG均明顯優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物,也是目前認(rèn)為唯一可預(yù)防腫瘤進(jìn)展的

2、免疫制劑.雖如此,仍有約30﹪左右的患者BCG治療和預(yù)防效果不理想,同時,BCG膀胱灌注具有較高的毒副作用發(fā)生率,如嚴(yán)重膀胱刺激癥狀、高熱、敗血癥、膀胱攣縮等,這極大地限制了其在臨床上的廣泛使用.因此,改造BCG菌株以提高其防治腫瘤的效果,同時減少其應(yīng)用劑量與毒副作用是目前研究的熱點(diǎn).采用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗(recombinant BCG,rBCG),增強(qiáng)BCG的免疫活性和抗瘤能力,被認(rèn)為是目前膀胱腫瘤免疫治療中最有發(fā)展?jié)摿Φ闹?/p>

3、療方法.既往的研究已證實(shí),細(xì)胞因子人干擾素α-2b(interferon-alpha 2b,IFN α-2b)與BCG聯(lián)合膀胱灌注可提高BCG的免疫活性和抗癌能力.但外源IFN α-2b存在應(yīng)用劑量大、副作用發(fā)生率高、作用時間短暫的缺點(diǎn),且費(fèi)用高昂.因此,通過基因工程技術(shù),將IFN α-2b基因重組入BCG,構(gòu)建能自動表達(dá)IFN α-2b的rBCG,有望提高BCG抗膀胱癌療效、降低BCG的應(yīng)用劑量與毒副作用. 二、研究目的

4、 通過基因重組技術(shù),構(gòu)建能自動表達(dá)人IFN α-2b的重組卡介苗(rBCG-IFNα-2b),并通過與人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和人膀胱癌細(xì)胞株的作用,了解其與普通BCG相比,是否具有更強(qiáng)的免疫活性和抗癌作用,為提高BCG抗膀胱癌療效、降低副作用提供科學(xué)依據(jù). 三、研究內(nèi)容和方法 1、卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定:采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)分別擴(kuò)增

5、人IFNα-2b和BCG Ag85B信號肽基因序列后,利用DNA重組技術(shù)將以上兩個片段先后插入質(zhì)粒pMV261結(jié)核桿菌hsp60啟動子下游,構(gòu)建分泌型卡介苗穿梭表達(dá)載體pMV261-Ag85B-IFN α-2b并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli),經(jīng)抽提和純化,對pMV261-Ag85B-IFN α-2b進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增及DNA測序鑒定. 2、重組卡介苗rBCG-IFN α-2b的構(gòu)建:利用電穿孔技術(shù)將pMV261-Ag85B.I

6、FN α-2b導(dǎo)入BCG,構(gòu)建rBCG-IFN α-2b并大量制備,分別用PCR擴(kuò)增和Western blotting檢測rBCG-IFN α-2b中目的基因的表達(dá)情況,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測rBCG-IFN α-2b培養(yǎng)上清中IFN α-2b蛋白的表達(dá)情況. 3、重組卡介苗rBCG-IFN α-2b抗膀胱癌細(xì)胞作用的研究:將rBCG-IFN α-2b作用于PBMC,觀察PBMC的增殖情況;將經(jīng)rBCG-IFN α-2b

7、刺激的PBMC作用于人膀胱癌細(xì)胞株T24、T5637,了解其與普通BCG等對照組相比,對膀胱癌細(xì)胞的殺傷情況. 四、結(jié)果 1、經(jīng)酶切、PCR和DNA測序鑒定,證實(shí)所克隆的BCGAg85B信號肽DNA片段和人IFN α-2b片段與文獻(xiàn)結(jié)果完全一致,pMV261-Ag85B-IFN α-2b的連接方向正確,閱讀框與預(yù)期一致. 2、利用電穿孔技術(shù)成功構(gòu)建rBCG-IFN α-2b:以rBCG-IFN α-2b質(zhì)粒DNA

8、為模板,通過PCR擴(kuò)增得到IFN α-2b的基因片段;Western blotting證實(shí)rBCG-IFN α-2b在蛋白水平目的基因可高效、穩(wěn)定的表達(dá),ELISA檢測只在rBCG-IFNα-2b培養(yǎng)上清中檢測到高表達(dá)的IFNα-2b蛋白為301.45pg/ml. 3、rBCG-IFN α-2b可明顯刺激人PBMC增殖,并隨刺激濃度的增加,PBMC的增殖水平也增加,且這種刺激作用迅速,在刺激的第1天,PBMC即有明顯增殖,并在刺

9、激后3d PBMC增殖達(dá)到高峰. 4、與普通BCG相比,rBCG-IFN α-2b激活的人PBMC對人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24、T5637具有更強(qiáng)的殺傷作用,差異有顯著性意義(P<0.01). 五、結(jié)論 1、正確構(gòu)建了卡介苗穿梭表達(dá)載體pMV261-Ag85B-IFN α-2b. 2、禾IJ用電穿孔技術(shù)成功構(gòu)建分泌人IFN α-2b的重組卡介苗rBCGIL-IFNα-2b,并在培養(yǎng)液中獲得高效、穩(wěn)定的表達(dá).