端粒相關(guān)中心體蛋白TACP1降解及ALT相關(guān)PML小體形成的分子機(jī)制研究.pdf

1、端粒是存在于真核生物線性染色體末端由核酸DNA重復(fù)序列和蛋白質(zhì)組成的特殊保護(hù)性結(jié)構(gòu)，端粒功能異常將導(dǎo)致細(xì)胞衰老和染色體不穩(wěn)定性，是人類腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一。中心體是高等真核生物細(xì)胞的主要微管組織中心，在細(xì)胞有絲分裂過程中起著至關(guān)重要的作用，與雙極紡錘體的形成、紡錘體的定向和胞質(zhì)分裂直接相關(guān)。中心體異常將損害細(xì)胞分裂的忠實性并導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性。從低等生物到人都有實驗證據(jù)證明端粒與細(xì)胞周期和有絲分裂之間存在密切聯(lián)系，但目前具體介導(dǎo)端粒與細(xì)胞

2、分裂之間相互關(guān)系的信號分子及功能尚不是很清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)TRFl在有絲分裂中期轉(zhuǎn)位于紡錘體極點/中心體部位，而過量表達(dá)TRF1將促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，提示TRF1可能是介導(dǎo)端粒和細(xì)胞分裂之間關(guān)系的信號分子。 在前期研究中，本課題組分離鑒定了一個新的TRF1相互作用蛋白并對該蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示該蛋白在細(xì)胞有絲分裂期定位于中心體，而siRNA基因干擾該蛋白會導(dǎo)致多極紡錘體形成，同時影響TRF1及Tankyr

3、ase1在中心體上的定位。根據(jù)該蛋白在有絲分裂期細(xì)胞的中心體定位以及siRNA敲除后對雙極紡錘體形成的影響，我們將該蛋白命名為端粒相關(guān)的中心體蛋白1(Telomere associated centrosomal protein1，TACP1)。 為更清楚的闡明TACP1在聯(lián)系端粒和細(xì)胞有絲分裂中扮演的角色，本課題第一部分研究以TACP1全長為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交篩庫，試圖尋找TACP1新的相互作用蛋白。通過酵母雙雜交，我們得到2

4、3個可能的TACP1相互作用蛋白，生物信息學(xué)分析顯示其中KIAA0649和HECTD3具有進(jìn)一步研究的意義。進(jìn)一步的酵母共轉(zhuǎn)及體外Pull-down實驗證實TACP1能和HECTD31-75相互作用。 泛素-蛋白酶體途徑是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性的最為重要的蛋白降解途徑，它通過選擇性的降解蛋白，精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的量，進(jìn)而對許多重要的細(xì)胞生理功能(如細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等)起到調(diào)節(jié)作用。許多中心體蛋白表達(dá)水平隨細(xì)

5、胞周期進(jìn)展而變化，其功能受到它們表達(dá)和降解的調(diào)控，而泛素-蛋白質(zhì)酶體途徑作為細(xì)胞內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)降解途徑，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白多數(shù)通過這條途徑降解。前期我們的實驗發(fā)現(xiàn)TACP1作為一個新的端粒相關(guān)中心體蛋白，是一個細(xì)胞周期性調(diào)節(jié)蛋白。為明確TACP1降解機(jī)制，本課題第二部分研究應(yīng)用免疫共沉淀結(jié)合Western免疫印跡技術(shù)檢測TACP1在體內(nèi)是否發(fā)生泛素化修飾。結(jié)果顯示TACP1在體內(nèi)能發(fā)生泛素化修飾，而加入蛋白酶體抑制劑MG132后，TAC

6、P1泛素化修飾條帶更為明顯，說明TACP1在體內(nèi)通過泛素-蛋白酶體途徑降解。泛素-蛋白酶體途徑最重要的特征就是底物的多樣性和選擇性，而這一功能是由泛素-蛋白連接酶E3s決定的。鑒于生物信息學(xué)分析顯示HECTD3是一個含有HECT結(jié)構(gòu)域的泛素-蛋白連接酶，其很可能是負(fù)責(zé)TACP1泛素化修飾的泛素-蛋白連接酶。為證實這個假設(shè)，本課題組設(shè)法得到HECTD3的全長，深入研究HECTD3對TACP1泛素化降解及功能的影響。酵母共轉(zhuǎn)及生化實驗證實T

7、ACP1和HECTD3存在相互作用，TACP1通過羧基端(332-476)和HECTD3相互作用，而HECTD3通過N端和TACP1相互作用；進(jìn)一步研究顯示HECTD3具有促進(jìn)TACP1泛素化修飾的作用；HECTD3對體內(nèi)TACP1蛋白的量具有負(fù)調(diào)控的作用，且該作用和其泛素-蛋白連接酶活性有關(guān)；而利用siRNA基因干擾抑制HECTD3蛋白表達(dá)將導(dǎo)致多極紡錘體的出現(xiàn)。綜上所述，本部分研究證明TACP1通過泛素-蛋白酶體途徑降解，而HECT

8、D3作為負(fù)責(zé)TACP1泛素化修飾的泛素-蛋白連接酶，通過調(diào)控TACP1降解進(jìn)而影響TACP1的功能，共同參與雙極紡錘體的形成。通過上述研究，基本闡明了TACP1降解的具體機(jī)制，為深入理解TACP1在細(xì)胞有絲分裂特別是維持中心體穩(wěn)定性中的作用提供新的實驗佐證。 由于DNA聚合酶末端復(fù)制問題，每次細(xì)胞分裂端粒就會丟失50-150 bp，當(dāng)端粒縮短至一定長度時(約4～5 kb)，細(xì)胞將不可逆地退出細(xì)胞周期進(jìn)入復(fù)制性衰老繼而死亡，因此端

9、粒被認(rèn)為是細(xì)胞的“有絲分裂鐘”，其長度直接反映了細(xì)胞的增殖分裂潛能。為獲得永生化的能力，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞系通過激活端粒酶來維持端粒長度，但部分神經(jīng)上皮或間充質(zhì)來源的腫瘤細(xì)胞如骨肉瘤、星形細(xì)胞瘤、里-費綜合癥，其端粒酶檢測陰性。這些腫瘤細(xì)胞通過激活端粒延伸替代機(jī)制(Alternative lengthening of telomeres，ALT)從而彌補(bǔ)隨細(xì)胞分裂而逐漸縮短的端粒長度。在ALT細(xì)胞中，存在一種特異性的ALT相關(guān)

10、的PML小體(ALT-associated PML，bodies，APBs)。ALT途徑通過染色體重組來維持端粒長度，而APBs又是端粒重組的場所，故完整的APBs結(jié)構(gòu)在ALT途徑維持腫瘤細(xì)胞端粒長度，保持細(xì)胞永生化中扮演著重要角色，但目前有關(guān)APBs形成的具體機(jī)制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)TRF1以及TRF1的SUMO化修飾和APBs的形成有關(guān)，但TRF1究竟是如何定位于APBs上，尚不清楚。 PML蛋白作為PML核小體(PML nucl

11、ear bodies，PNBs)最主要的組份，在PML核小體的形成中起到重要作用。根據(jù)PML基因外顯子剪接方式的不同，PML共有7個拼接異構(gòu)體PML1～7。目前有關(guān)PML各個異構(gòu)體的研究尚不多，主要集中在PML3和PML4這兩個異構(gòu)體。研究顯示，PML3能夠?qū)53招募到PML核小體上進(jìn)而促進(jìn)P53的轉(zhuǎn)錄活性。 鑒于PML3的作用，我們設(shè)想在ALT細(xì)胞中TRF1通過和PML3的相互作用而被招募到PML核小體上。為證明這個假設(shè)，在

12、本課題第三部分研究中，我們首先通過生化實驗證實PML3和TRF1在體內(nèi)外均有相互作用。進(jìn)一步免疫熒光實驗顯示在ALT細(xì)胞中，TRF1和PML3共定位于APBs；TRF1在APBs上的定位和細(xì)胞周期密切相關(guān)，以G2/M期最高；外源性過表達(dá)PML3能招募TRF1上PML核小體；而利用siRNA基因干擾抑制內(nèi)源性PML3蛋白表達(dá)，不僅會抑制TRF1在APBs上的定位，對TRF2在APBs上的定位也有影響，提示PML3對于APBs的形成至關(guān)重要

13、。本研究首次發(fā)現(xiàn)PML3具有招募TRF1上PML核小體的作用，且PML3對于APBs的形成至關(guān)重要，為闡明ALT相關(guān)PML小體形成的分子機(jī)制提供新的實驗證據(jù)。 綜上所述，本研究可分為兩個部分。 在第一、二部分研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)TACP1通過泛素一蛋白酶體途徑降解，而HECTD3作為負(fù)責(zé)TACP1泛素化修飾的泛素一蛋白連接酶，通過調(diào)控TACP1降解進(jìn)而影響TACP1的功能，共同參與雙極紡錘體的形成。通過研究，基本闡明了T