PML-RARα融合蛋白調(diào)控組織因子表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、組織因子（tissue factor, TF）的異常高表達(dá)是導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia, APL）嚴(yán)重出凝血障礙的關(guān)鍵因素之一。在APL中，特征性的PML/RARα融合蛋白可以誘導(dǎo)TF異常增高，本研究的目的在于闡明PML/RARα融合蛋白調(diào)控TF表達(dá)的分子機(jī)制。 按照啟動(dòng)子截短分析策略，將TF基因5’側(cè)翼序列不同長度的TF啟動(dòng)子截短片斷構(gòu)建入熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)

2、粒電轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)937-PR9細(xì)胞建立穩(wěn)定細(xì)胞株，分析PML/RARα融合蛋白調(diào)控TF啟動(dòng)子的活性區(qū)域。熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)，PML/RARα融合蛋白表達(dá)可以上調(diào)TF啟動(dòng)子的熒光素酶活性，其調(diào)控的活性區(qū)域位于TF啟動(dòng)子的（-247～-201）區(qū)域。應(yīng)用Anti-RARα抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀分析，發(fā)現(xiàn)在U937-PR9細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)PML/RARα融合蛋白時(shí)，包含TF啟動(dòng)子區(qū)域（-247～-201）的PCR片斷擴(kuò)增產(chǎn)物明顯增多，這提示在

3、U937-PR9細(xì)胞中PML/RARα融合蛋白與TF啟動(dòng)子存在結(jié)合。為了明確PML/RARα融合蛋白與TF啟動(dòng)子的結(jié)合方式，根據(jù)TF啟動(dòng)子活性區(qū)域的DNA堿基序列合成EMSA探針，分別應(yīng)用體外翻譯的RARα及PML/RARα融合蛋白、Zn2+誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的U937-PR9細(xì)胞核蛋白與上述探針進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)體外翻譯的RARα、PML/RARα融合蛋白與TF啟動(dòng)子區(qū)域（-247～-201）直接結(jié)合的證據(jù)，因此推測U937-PR

4、9細(xì)胞核蛋白中PML/RARα融合蛋白可能是以核蛋白復(fù)合物的形式與TF啟動(dòng)子間接結(jié)合。另外，在TF啟動(dòng)子的活性區(qū)域（-247～-201）中存在兩個(gè)AP-1的保守結(jié)合序列AP-1d（distal AP-1）及AP-1p（proximal AP-1)，尤其是AP-1p，在PML/RARα融合蛋白表達(dá)時(shí)，U937-PR9細(xì)胞核蛋白中AP-1與AP-1p的結(jié)合能力明顯增強(qiáng)。將TF啟動(dòng)子上兩個(gè)AP-1保守結(jié)合序列突變，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析，發(fā)

5、現(xiàn)AP-1的保守結(jié)合序列突變后，PML/RARα融合蛋白仍具有上調(diào)TF啟動(dòng)子活性的功能。 PML/RARα融合蛋白的表達(dá)可以上調(diào)TF啟動(dòng)子的熒光素酶活性，其調(diào)控的活性區(qū)域位于TF啟動(dòng)子（-247～-201）之間；PML/RARα融合蛋白可能與核蛋白組分形成復(fù)合物間接與TF啟動(dòng)子結(jié)合；PML/RARα融合蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)TF啟動(dòng)子活性區(qū)域內(nèi)AP-1p與AP-1的結(jié)合能力；突變AP-1保守結(jié)合序列后，PML/RARα融合蛋白的表達(dá)仍

6、具有上調(diào)TF啟動(dòng)子的活性。因此在TF啟動(dòng)子上AP-1保守結(jié)合序列之外的區(qū)域還存在PML/RARα融合蛋白上調(diào)TF啟動(dòng)子活性的DNA調(diào)控序列，這需要進(jìn)一步深入研究。為了研究Rituximab （美羅華）和SAHA對B細(xì)胞淋巴瘤的療效及其作用機(jī)制，應(yīng)用SU-DHL-4細(xì)胞及Daudi細(xì)胞注入SICD小鼠，建立淋巴瘤小鼠模型。分別給予Rituximab、SAHA、Rituximab聯(lián)合SAHA治療Daudi淋巴瘤小鼠。觀察小鼠的發(fā)病時(shí)間及其生

7、存時(shí)間，并研究其臟器及骨髓的累及情況。 結(jié)果提示Daudi淋巴瘤小鼠模型的臟器受Daudi細(xì)胞累及，骨髓中大量Daudi細(xì)胞浸潤。接受SAHA、Rituximab聯(lián)合SAHA治療的小鼠骨髓中Daudi細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。Daudi細(xì)胞注入SCID 小鼠后，未接受治療組小鼠于30天左右出現(xiàn)下肢癱瘓，40天左右死亡。Rituximab治療組下肢癱瘓時(shí)間54.3天，死亡時(shí)間75.5 天，SAHA治療組小鼠下肢癱瘓時(shí)間52.7天，死