白癜風(fēng)黑素細胞凋亡小體形成及自身抗原再定位的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　白癜風(fēng)是一種常見的以皮膚黑素細胞破壞為特征的色素脫失性疾病，該病發(fā)病機制尚不明確。近年來研究表明：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)所致的凋亡可能在表皮黑素細胞損傷中起到起始作用，凋亡的黑素細胞蛋白具有免疫源性，可以誘導(dǎo)針對自身抗原的免疫應(yīng)答，繼而造成黑素細胞免疫損傷，加劇黑素細胞破壞，導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)生。另外，白癜風(fēng)皮損周可見細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic lymphocyte，CTL）浸潤，可靶向殺傷黑素細胞，且白癜風(fēng)患者血液中含

2、有針對黑素細胞的特異性抗體，以上證據(jù)提示細胞、體液免疫應(yīng)答是黑素細胞破壞的主要效應(yīng)環(huán)節(jié)。前期諸多研究明確了特異性免疫應(yīng)答所識別的白癜風(fēng)相關(guān)抗原，但胞內(nèi)抗原的暴露、識別、吞噬的分子機制尚不明確。
　　凋亡小體（Apoptotic Bodies，ABs）的功能近年來逐漸被人們所關(guān)注，研究表明ABs包含自身免疫相關(guān)蛋白，主要包括熱休克蛋白，組蛋白，表面蛋白烯醇化酶（Enolase）等。同時紅斑狼瘡（Systemic lupus eryt

3、hematosus，SLE）相關(guān)研究也表明自身抗原在細胞凋亡過程中逐漸向細胞表面富集，抗原組分通過膜出泡的形式再定位于ABs，ABs進一步被周圍的吞噬細胞或非專職呈遞細胞所吞噬，形成自身抗原的免疫呈遞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在胰島素瘤來源的間充質(zhì)干細胞研究中，細胞外囊泡包含有自身抗原及免疫佐劑，可誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答。另外，Buzas等人研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激及損傷等條件下，細胞釋放ABs，內(nèi)含損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated mole

4、cular patterns，DAMPs)，可以誘導(dǎo)及維持炎癥的發(fā)生和發(fā)展。這些研究提示，ABs是自身抗原及危險信號的重要載體，在自身免疫疾病中起著關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)對我們的白癜風(fēng)研究帶來了新的思考與探索，即氧化應(yīng)激下黑素細胞是否也形成ABs，是否也包含相關(guān)自身抗原，是否也參與了白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展，ABs是否能成為連接氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡與免疫介導(dǎo)黑素細胞破壞之間的橋梁？
　　基于文獻回顧和課題組以往研究，針對上述疑問，我們提出如下假設(shè)

5、：氧化應(yīng)激通過激活JNK、caspase等凋亡信號通路，啟動自身抗原成分形成ABs，促進活化的表朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LC）識別、吞噬ABs，最終誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答發(fā)生，促進白癜風(fēng)發(fā)展。
　　方法：
　　本研究使用白癜風(fēng)永生化黑素細胞系（PIG3V），利用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡，分離純化ABs，透射電鏡形態(tài)學(xué)鑒定ABs，流式細胞術(shù)檢測微粒表面磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）的表達，

6、進一步鑒定ABs質(zhì)量，Western Blot鑒定ABs中相關(guān)抗原組分，蛋白質(zhì)組學(xué)驗證Western Blot結(jié)果，免疫電鏡觀察抗原與ABs共定位情況。觀察不同氧化應(yīng)激條件下ABs的形態(tài)學(xué)改變，Western Blot檢測ABs中抗原再定位情況，流式細胞術(shù)檢測ABs的形成情況（FSC/SSC分析），分析自身抗原表達量、ABs形成與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)時間、劑量是否存在正相關(guān)，探討自身抗原、ABs形成以及氧化應(yīng)激之間的關(guān)聯(lián)性；在穩(wěn)定的凋亡模型的基

7、礎(chǔ)上，利用JNK、caspase、骨架蛋白激活等激酶抑制劑預(yù)處理PIG3V細胞，Western Blot檢測ABs中抗原蛋白量的變化，流式檢測ABs形成的變化，觀察相關(guān)信號通路激酶抑制劑對ABs形成及抗原再定位的影響，明確參與ABs形成的信號通路。
　　結(jié)果：
　　1．選擇由低到高濃度的H2O2，處理黑素細胞24h后檢測細胞的凋亡情況并做統(tǒng)計學(xué)分析，明確造成凋亡有統(tǒng)計學(xué)意義而壞死無明顯差異的濃度800μmol/l，成功建立黑

8、素細胞凋亡模型。
　　2．分離純化ABs，進行電鏡形態(tài)學(xué)鑒定，進一步流式鑒定表面PS表達明確90％以上被檢顆粒為Annexin V陽性，提示我們成功分離純化了ABs。
　　3．選取已經(jīng)明確的白癜風(fēng)相關(guān)抗原蛋白抗體TYR，TYRP-1，TYRP-2及我們課題組前期發(fā)現(xiàn)的Lamin A及Lamin A（ASP230）等進行ABs總蛋白的Western Blot實驗，明確了Lamin A（ASP230），TYRP-1在凋亡過程中可

9、再定位于ABs。進一步研究明確胞質(zhì)及核內(nèi)自身免疫性相關(guān)抗原蛋白也可在凋亡過程中再定位于ABs。蛋白質(zhì)組學(xué)證實了Western Blot結(jié)果。免疫電鏡的方法觀察到了陽性抗原與ABs存在共定位。
　　4．對黑素細胞進行不同強度及不同時間的氧化應(yīng)激刺激，電鏡形態(tài)學(xué)鑒定ABs，發(fā)現(xiàn)隨著刺激濃度增加，ABs形態(tài)無明顯改變，但接近壞死濃度時，ABs較少，大部分為壞死細胞碎片。進一步觀察不同時間ABs變化，發(fā)現(xiàn)隨著刺激時間的延長，ABs逐漸腫脹

10、，破碎。
　　5．對黑素細胞進行不同強度及不同時間的氧化應(yīng)激刺激，Western Blot發(fā)現(xiàn)ABs中陽性抗原蛋白與氧化應(yīng)激刺激強度及時間呈正相關(guān)。進一步流式細胞術(shù)檢測ABs形成情況，發(fā)現(xiàn)ABs形成與氧化應(yīng)激刺激強度和時間呈正相關(guān)。
　　6．利用JNK抑制劑SP600125、caspase抑制劑Z-VAD、骨架蛋白激活激酶抑制劑Y-27632及ML-9預(yù)處理細胞后誘導(dǎo)凋亡，分離純化ABs，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)抑制

11、相關(guān)信號通路可以抑制陽性抗原再定位于ABs，流式檢測ABs的形成，發(fā)現(xiàn)抑制相關(guān)信號通路可以抑制ABs的形成，以上結(jié)果提示：JNK、caspase、骨架蛋白激活相關(guān)信號通路參與抗原再定位及ABs形成。
　　結(jié)論：
　　本研究成功分離純化了PIG3V細胞來源的ABs，鑒定明確ABs含有Lamin A（ASP230）、TYRP-1等白癜風(fēng)相關(guān)抗原蛋白，JNK、caspase、骨架蛋白激活等信號通路參與ABs形成及抗原再定位。綜合文

12、獻及我們研究結(jié)果提示，氧化應(yīng)激通過激活JNK信號通路啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡，白癜風(fēng)相關(guān)抗原參與形成ABs。高強度及長時間氧化應(yīng)激條件下ABs膜完整性受損，抗原蛋白可由ABs釋放至膜外，提示ABs可能為胞內(nèi)抗原直接外泄的途徑。綜上所述，本研究首次明確了在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細胞凋亡后自身抗原變形凝集于ABs，胞內(nèi)抗原暴露，為特異性CTL克隆及活化自反應(yīng)性B細胞提供了可能的抗原來源，為氧化應(yīng)激啟動自身免疫反應(yīng)的機制提供了新證據(jù)，對于