一個(gè)與端粒結(jié)合蛋白TRF1相互作用的新蛋白：端粒相關(guān)中心體蛋白（TACP1）的鑒定及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、端粒是真核細(xì)胞染色體末端由DNA重復(fù)序列和多種結(jié)合蛋白組成的特殊保護(hù)性結(jié)構(gòu)。染色體復(fù)制存在“末端復(fù)制問(wèn)題”，即隨著細(xì)胞分裂端粒逐漸縮短，當(dāng)端粒縮短至一定長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞失去分裂增殖能力而衰老隨后凋亡。端粒異常將導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，而染色體的不穩(wěn)定性與細(xì)胞衰老和腫瘤密切相關(guān)。端粒酶是一種具有逆轉(zhuǎn)錄活性的核糖核蛋白酶復(fù)合物，端粒酶以自身RNA模板合成端粒重復(fù)序列添加于染色體末端以補(bǔ)償因細(xì)胞分裂而縮短的端粒DNA序列。端粒酶是細(xì)胞維持端粒長(zhǎng)度的最主

2、要途徑。正常人成體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶活性，而85％以上腫瘤細(xì)胞和永生化細(xì)胞端粒酶活性明顯增高，提示端粒酶在細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。 許多證據(jù)顯示端粒長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的維持及端粒酶活性受到一組端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控。目前至少發(fā)現(xiàn)三組端粒結(jié)合蛋白：端粒雙鏈DNA結(jié)合蛋白與相關(guān)蛋白、端粒單鏈DNA結(jié)合蛋白與相關(guān)蛋白及某些參與DNA損傷修復(fù)且也定位在端粒上的蛋白質(zhì)。TRF1是以端粒序列[TTAGGG]27為探針用離子交換與親和層析法

3、分離純化獲得的第一個(gè)人端粒雙鏈DNA結(jié)合蛋白。TRF1以同源二聚體形式與端粒雙鏈DNA結(jié)合，促使端粒末端環(huán)狀三級(jí)結(jié)構(gòu)T-loop的形成，保護(hù)端粒末端。TRF1是端粒長(zhǎng)度負(fù)調(diào)控因子，過(guò)量表達(dá)TRF1可抑制端粒酶活性并引起端?？s短，而大量表達(dá)其功能缺失突變體則使端粒延長(zhǎng)。TRF1可與Tin2、Tankyrase、PinX1、Pot1等其它端粒結(jié)合蛋白相互作用。Tankyrase催化TRF1使其多聚核糖腺苷化并從端粒部位解離暴露端粒酶結(jié)合位點(diǎn)

4、，使端粒酶與端粒結(jié)合而發(fā)揮延長(zhǎng)端粒作用。TRF1和Tankyrase在細(xì)胞有絲分裂期可定位于中心體，而且TRF1過(guò)量表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，提示TRF1和Tanryrase還參與了細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控。 中心體是高等真核生物細(xì)胞的主要微管組織中心。中心體在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用。其與雙極紡錘體的形成，紡錘體的定向和胞質(zhì)分裂直接相關(guān)。中心體異常將損害細(xì)胞分裂的忠實(shí)性并導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定。酵母的中心體功能同源物紡錘體

5、極體(Spindlepolebody，SPB)嵌在核膜上，在酵母細(xì)胞分裂時(shí)組織細(xì)胞核紡錘體微管成核。盡管高等真核生物中心體與酵母SPB形態(tài)上有明顯的差別，但在蛋白質(zhì)組成上卻具有保守性。如芽殖酵母Spc110p、裂殖酵母Pcp1和脊椎動(dòng)物的Pericentrin/Kendrin等中心體/SPB蛋白均由Coiled-coil結(jié)構(gòu)域組成。最新研究顯示酵母端粒結(jié)合蛋白spTaz1(TRF1同源物)與中心體蛋白Pcp1具有相互作用。但在人類細(xì)胞中

6、端粒結(jié)合蛋白TRF1及其復(fù)合物是否與中心體蛋白有關(guān)以及作用機(jī)理尚不清楚。 本研究利用TRF1特異性抗體通過(guò)免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)肽指紋譜技術(shù)從分裂期細(xì)胞中分離鑒定了一個(gè)TRF1新的相互作用蛋白。該蛋白質(zhì)與人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)放閱讀框AAH03618編碼的蛋白質(zhì)相匹配，氨基酸序列分析顯示該蛋白質(zhì)氨基端有一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，羧基端有二個(gè)Coiled-coil結(jié)構(gòu)域，并且這兩個(gè)Coiled-coil結(jié)構(gòu)域形成SMC功能區(qū)。進(jìn)一步序列比對(duì)分析發(fā)

7、現(xiàn)該蛋白質(zhì)與裂殖酵母中心體蛋白Pcp1同源。我們將該蛋白質(zhì)命名為端粒相關(guān)的中心體蛋白1(Telomereassociatedcentrosomalprotein1，TACP1)。隨后，從人睪丸cDNA文庫(kù)中克隆了TACP1基因全長(zhǎng)cDNA并進(jìn)行了相應(yīng)的亞克隆和突變。通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRF1與TACP1在體內(nèi)的相互作用并鑒定了TACP1通過(guò)其羧基端與TRF1相互結(jié)合。免疫熒光染色定位研究顯示TACP1在間期細(xì)胞與TRF1共同定位在端粒上

8、，而細(xì)胞周期進(jìn)展至有絲分裂中期時(shí)共定位于中心體。免疫電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示TACP1在分裂期細(xì)胞定位于中心粒周圍。根據(jù)不同突變體定位結(jié)果提示TACP1中心體定位依賴于中間的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步的研究表明TRF1的中心體定位依賴于TACP1的相互作用。轉(zhuǎn)染siRNA抑制TACP1的表達(dá)導(dǎo)致TRF1在中心體定位消失，這證實(shí)了TACP1對(duì)TRF1中心體定位的調(diào)控作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示TACP1對(duì)Tankyrase1的中心體定位也

9、具有調(diào)控作用。通過(guò)siRNA抑制TACP1的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞中心體數(shù)目異常和多極紡錘體形成以及染色體排列異常，說(shuō)明TACP1在維持染色體穩(wěn)定性中具有重要調(diào)控作用。從單細(xì)胞生物酵母到人，TACP1蛋白在氨基酸序列和功能上都具有保守性，因此我們推測(cè)TACP1通過(guò)招募TRF1和Tankyrase1在中心體定位調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程。 為深入探討TACP1的細(xì)胞生物學(xué)功能，我們建立了TACP1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)一步研究了TACP1在細(xì)胞周

10、期進(jìn)展過(guò)程中蛋白質(zhì)水平的表達(dá)特征及其調(diào)控方式。Western免疫印跡檢測(cè)顯示，TACP1蛋白水平呈細(xì)胞周期性調(diào)節(jié)，以G2/M期為表達(dá)高峰，細(xì)胞退出有絲分裂后其蛋白水平快速下調(diào)，而這種下調(diào)可能是通過(guò)蛋白質(zhì)酶體途徑降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的。雙向電泳和去磷酸化實(shí)驗(yàn)證實(shí)TACP1是一個(gè)磷酸化蛋白，細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期TACP1發(fā)生特異性磷酸化，這可能是TACP1在分裂期發(fā)生轉(zhuǎn)位和對(duì)中心體功能調(diào)控的重要機(jī)制。通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定了TACP1的兩個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)Th