AF-1與UG結(jié)合蛋白相互作用及生物學意義的初步研究.pdf

1、子宮珠蛋白(uteroglobin,UG)是一種具有多種生物活性的小分子分泌性蛋白。在呼吸系統(tǒng),UG主要由襯覆于遠端細支氣管的非纖毛上皮細胞Clara細胞所分泌,因此也稱為Clara細胞分泌蛋白(Clara cell secretoryprotein,CCSP)、Clara細胞蛋白10(CC10)等。UG新近被正式確定為分泌珠蛋白家族成員1A1(secretoglobin,family 1A,member 1,SCGB1A1)。

2、　　UG最早在兔的子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)并由此命名,研究顯示,子宮、胸腺、垂體、肺、胃腸道、胰腺、乳腺、前列腺等多種組織均可表達UG,但以肺和支氣管的表達水平最高,其在肺內(nèi)的表達強度可比前列腺、子宮內(nèi)膜等組織高20倍。UG具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞外基質(zhì)侵襲、抑制成纖維細胞趨化、抑制TH2細胞活化等多種生物活性。UG作為肺內(nèi)源性保護因子已經(jīng)日益受到重視,并有望成為某些疾病治療的有效手段。
　　Antiflammins(簡稱AF

3、s)是與UG的第三個α螺旋中的保守序列以及脂皮素序列中的某些保守序列高度同源的一類寡肽的統(tǒng)稱,由于最初發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)具有強的抗炎作用而命名。其中,Antiflammin-1(簡稱AF-1)對應于UG分子中第39-47位的氨基酸(MQMKKVLDS),由疏水氨基酸殘基組成,其C端的氨基酸殘基Lys和Asp分別對應于UG的第43位Lys和第46位Asp。AF-1具有強的抗炎及抑制黏附等多種與UG全長蛋白相似的生物活性。與大分子天然蛋白相比,活性

4、寡肽分子量更小,具有更低免疫原性和潛在的應用前景。肺纖維化是嚴重危害健康的呼吸系統(tǒng)常見并發(fā)癥,是多種病因不同的肺間質(zhì)疾病的最后共同結(jié)局。肺纖維化的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢,五年存活率不足50％。肺纖維化的發(fā)病機制遠未闡明,至今仍無特效的治療方法,目前多種抗肺纖維化的治療并未能有效地改善其不良預后。探討新的肺纖維化治療的途徑,是肺纖維化研究的活躍領(lǐng)域。目前對肺纖維化發(fā)生的研究,主要集中在促纖維化機制的研究,對肺纖維化負性調(diào)控機制的研究

5、較少。
　　本室研究曾首次證實肺內(nèi)分泌UG的Clara細胞具有抗肺纖維化的效應,提示了UG對肺纖維化進程的負性調(diào)控作用。隨后有研究表明,UG基因敲除小鼠更易發(fā)展成為肺纖維化,進一步提示了UG的抗肺纖維化效應。UG可能是肺內(nèi)天然存在的肺纖維化負性調(diào)控因子。但目前UG及其活性片段生物學作用的機制還遠未闡明。
　　UG的生物學作用可能有賴于子宮珠蛋白結(jié)合蛋白(UG結(jié)合蛋白,Uteroglobin-binding protein,U

6、GBP)的介導,但目前對UGBP的基因結(jié)構(gòu)和生物學功能還了解甚少。Kundu等曾用Affinity cross-linking方法在小鼠成纖維細胞NIH3T3和某些鼠的癌細胞上先后發(fā)現(xiàn)了兩種UG的結(jié)合蛋白。DiazGonzalez和Nieto等通過Gel filtration也發(fā)現(xiàn)過另外可以結(jié)合UG的蛋白質(zhì)。然而,由于這些結(jié)合蛋白在當時均未被克隆和鑒定,這些表觀分子大小不同的蛋白究竟屬于同一種蛋白的不同亞基或者多聚體還是完全不同的蛋白質(zhì)

7、并不清楚,它們之間的關(guān)系也不明確。小鼠的UG結(jié)合蛋白(uteroglobin-binding protein,UGBP,也稱UG受體,uteroglobin receptor)基因于2001年克隆。生物信息學分析顯示UGBP可能是具有9次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白。
　　目前,國內(nèi)外對UGBP的基因結(jié)構(gòu)和生物學功能了解甚少,對其研究均遠遠滯后于對其天然配體UG的研究,這將限制對UG生物學功能的全面深入的認識,也必將限制其可能的臨床應用。因此

8、,針對目前UG結(jié)合蛋白研究滯后這一現(xiàn)狀而進行探索性研究具有重要意義。由于Antiflammin-1(AF-1)是源于UG的C端保守序列的寡肽,對應于UG的第3個α螺旋的第39-47位氨基酸序列,具有與UG全長蛋白相似的生物活性,文獻報道,第3個α螺旋是UG與其他蛋白相互作用的部位,因此,研究AF-1與UGBP的相互作用及意義十分必要。探討UGBP與其配體的相互作用的特點及意義,將有助于進一步闡明UG及其活性片段生物學作用的機制,并為UG

9、及衍生物可能的臨床應用提供理論依據(jù)。
　　本文共分為四章。在對小鼠UG結(jié)合蛋白(mUGBP)進行生物信息學分析預測的基礎(chǔ)上,本研究對mUGBP的亞細胞定位、UG的C端寡肽AF-1與mUGBP蛋白在活細胞上的結(jié)合特性、對小鼠成纖維細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化的影響,以及生物學意義等方面進行了初步探討。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR方法進行了mUGBP cDNA的克隆,將mUGBP cDNA克隆至真核表達載

10、體pEGFP-N1,構(gòu)建了增強型綠色熒光蛋白與小鼠UG結(jié)合蛋白——mUGBP的融合表達載體pUGBP-EGFP。用GFP標簽技術(shù)對mUGBP蛋白在COS-1細胞中的定位進行了研究。同時,本研究制備了兔抗mUGBP蛋白的多克隆抗體,用制備的mUGBP抗體對已經(jīng)證實的有mUGBP基因表達的小鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞進行亞組分Western blot分析和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),mUGBP蛋白主要在細胞質(zhì)膜組分中表達。
　　2.在本文第

11、二部分的研究中,用熒光染料Cy5標記了AF-1,與克隆至綠色熒光載體的mUGBP蛋白在COS-1細胞中進行了共定位研究。在培養(yǎng)條件下直接用激光共聚焦鏡觀察發(fā)現(xiàn),mUGBP與EGFP融合蛋白的表達和Cy5-AF-1呈完全共定位關(guān)系,提示了AF-1與mUGBP在活細胞上可相互結(jié)合的性質(zhì);進而,用熒光染料Cy5標記的寡肽AF-1作為探針,用流式細胞分析方法檢測了AF-1與mUGBP陽性表達細胞——小鼠成纖維細胞NIH3T3之間的結(jié)合,在完整細

12、胞上進行的FACS配體結(jié)合分析實驗結(jié)果表明,AF-1與NIH3T3細胞之間的結(jié)合具有競爭抑制的特征。AF-1與mUGBP陽性表達細胞NIH3T3結(jié)合的Kd值在29.19~46.33nM之間,具有較高親和力。Scatchard作圖呈線性,結(jié)合符合簡單位點系統(tǒng)的特征。AF-1與mUGBP具有相互結(jié)合特性的初步明確,為進一步探討二者相互作用的意義及對細胞功能的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　3.本研究的第三部分探討了AF-1對成纖維細胞NIH 3

13、T3細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化的影響,并以磷酸化ERK1/2蛋白表達水平的改變作為AF-1與mUGBP相互作用后的一種的細胞效應,檢測了mUGBP蛋白表達水平與ERK1/2磷酸化水平之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明,AF-1可以增加mUGBP陽性表達的NIH3T3細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2蛋白的表達水平,劑量依賴關(guān)系及時間依賴關(guān)系明顯。AF-1可以同時激活ERK1和ERK2,但在同樣的條件下p42 MAPK(ERK2)可以被更多更有效地激活。構(gòu)建并

14、篩選到有效抑制mUGBP表達的shRNA真核表達載體,觀察了用pShUGBP敲減mUGBP表達后對NIH3T3細胞磷酸化ERK1/2蛋白表達水平的影響,發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染pShUGBP的NIH3T3細胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達水平明顯低于對照組細胞,首次提示了mUGBP與AF-1介導的小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞內(nèi)ERK磷酸化改變之間的關(guān)聯(lián)。此外,用Real time PCR array方法在小鼠成纖維細胞NIH3T3上篩選到敲減mUG

15、BP基因表達后Mdm2、Egr1、Fos等差異表達的信號通路分子,為揭示mUGBP相關(guān)的信號通路和進一步的功能研究提供了啟示。
　　4.本文的第四部分研究了mUGBP在小鼠肺纖維化模型肺組織內(nèi)的表達變化特點,首次發(fā)現(xiàn)mUGBP在正常與肺纖維化肺組織之間存在表達差異。但是,mUGBP在肺纖維化時表達上調(diào)和分布不均一特點的生物學意義目前還不明確。在小鼠成纖維細胞系NIH 3T3上的初步研究結(jié)果表明,AF-1對TGF-β1誘導的成纖維細

16、胞膠原表達的抑制效應與mUGBP的表達水平關(guān)系密切,提示mUGBP表達水平可能與不同條件下細胞對配體反應性不同相關(guān),但相關(guān)機制還有待進一步研究證實。
　　結(jié)論:①mUGBP蛋白主要定位于細胞質(zhì)膜上;②UG活性片段AF-1可與完整活細胞上mUGBP特異性結(jié)合,其結(jié)合符合簡單位點系統(tǒng)的特征,可被競爭抑制,Kd值在29.19~46.33nM之間,具有較高親和力;③AF-1通過mUGBP的介導可影響小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞內(nèi)ERK磷

17、酸化水平:④mUGBP在正常與肺纖維化肺組織之間存在表達差異。AF-1對TGF-β1誘導的成纖維細胞膠原表達的抑制效應與mUGBP的表達水平關(guān)系密切。以上研究結(jié)果首次表明,小鼠UG結(jié)合蛋白(mUGBP)主要在質(zhì)膜表達,UG活性片段AF-1在完整活細胞上與mUGBP特異結(jié)合,并引起信號通路分子ERK1/2磷酸化水平的改變。上述結(jié)論進一步支持UGBP作為AF-1功能受體的假說,相關(guān)機制和功能意義值得進一步研究探討。mUGBP在正常與肺纖維化