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文檔簡介
1、目的:建立以磁分離技術為核心的分離系統,摸索制備具有非特異吸附性能的裸磁珠及其包被的條件,為下一階段免疫磁珠的制備奠定基礎。同時建立以蠟樣芽胞桿菌為代表的芽胞桿菌I群大細胞群細菌的TaqMan實時熒光PCR快速檢測方法,并對該方法進行了初步的優(yōu)化、評價及應用。 方法: 本研究分為兩部分內容: 1.裸磁珠的制備及包被 1.1磁珠的制備 Fe<'2+>和Fe<'3+>分別與OH離子反應生成Fe(OH)
2、<,2>和Fe(OH)<,3>,Fe(OH)<,2>和Fe(OH)3不穩(wěn)定,分別降解生成FeO和Fe<,2>O<,3>,即最后生成了Fe<,3>O<,4>。用蒸餾水洗滌磁珠至中性,并用磁分離架進行分離。 1.2磁珠的包被 以1%的醋酸溶解殼聚糖,將殼聚糖包被于制備好的裸磁珠表面后,進而再包被上作為交聯劑的戊二醛。 2.TaqMan實時熒光PCR快速檢測芽胞桿菌I群大細胞群細菌方法的建立 通過比較大量芽胞桿
3、菌I群大細胞群細菌的特異性基因,最終選擇ITs基因作為檢測的目的片段。從Gen/Bank中下載ITS基因序列并進行同源性比較,選擇保守區(qū)段進行引物和探針的設計。對比CTAB法和硅膠模型基因組DNA提取法兩種DNA提取方法,選取實時熒光PCR快速檢測方法建立初期,合適的DNA標準制備方法。同時,通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度、探針濃度、Mg<'2+>濃度、dNTPs濃度、Taq酶濃度以及緩沖液濃度,以建立起TaqMan實時熒光PCR快速檢測芽
4、胞桿菌I群大細胞群細菌的方法。最后,檢驗該方法的靈敏度和特異性,并對模擬樣品進行了檢測。 結果: 1.磁珠的制備和包被 成功制備出裸磁珠,經透射電鏡觀察,裸磁珠直徑達到納米級,制備的磁珠在溶液中懸浮性較好,在磁場的作用下可較好的分離該磁性微粒。殼聚糖溶解于1%醋酸后用于包被制備的磁珠,包被磁珠體積增大,可用于連接抗體,為后續(xù)免疫磁珠的制備奠定了基礎。 2.選取16S-23S rDNA基因間區(qū)序列作為目的基
5、因設計引物和探針如下:上游引物:5’-GAGTCCATTIAGGCCCACCATIAC-3'下游引物:5’-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3'TaqMan探針:5’-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3’ 經過優(yōu)化,成功建立了以蠟樣芽胞桿菌為代表的芽胞桿菌I群大細胞群TaqMan實時熒光PCR的快速檢測方法,優(yōu)化后的反應體系如下表所示。并通過比較,最終選取硅膠模型基因組DNA提
6、取法,成功制備了該檢測方法的DNA初標準。同時該方法的評測結果顯示,該方法的檢測靈敏度達到172fg,菌液靈敏度達到22cfu/反應體系;且該方法特異性較好,可同時檢測包括蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、覃狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌在內的4種芽胞桿菌I群大細胞群細菌。 本研究為建立常見食源性病原菌快速檢測系統,在分離手段上成功制備了納米級的裸磁珠和包被磁珠,為下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基礎。同時,成功建立了芽胞桿菌I群大細胞群
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