生物功能化粒子-核酸探針技術(shù)快速檢測(cè)病原菌及ATP的研究.pdf

1、病原菌引起的感染性疾病是近年威脅人類健康和造成社會(huì)恐慌的主要因素,同時(shí)也是造成人類死亡的重要原因。檢測(cè)任務(wù)的緊迫性與檢測(cè)樣品的復(fù)雜性給傳統(tǒng)病原菌檢測(cè)方法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),而傳統(tǒng)的檢測(cè)方法由于在特異性、靈敏度、操作簡(jiǎn)便性、快捷性等方面存在缺陷,難以滿足日益發(fā)展的病原菌快速檢測(cè)的需要。因此發(fā)展病原菌的快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。納米材料有著獨(dú)特的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng),在其表面進(jìn)行各種修飾獲得的各

2、種功能化納米材料與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相結(jié)合,衍生出具有高通量、高靈敏、快速檢測(cè)的方法;核酸探針技術(shù)是目前分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一,是定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA序列的有力工具。本論文以三種納米粒子和核酸探針技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合新型的檢測(cè)工具,發(fā)展了新的靈敏度高、特異性好的病原菌及ATP分子檢測(cè)技術(shù)。
　　 本論文主要包括以下幾個(gè)研究?jī)?nèi)容:
　　 (1)構(gòu)建了基于免疫磁珠(Immunomolecular magnetic

3、 beads,IMBs)/表面等離子共振技術(shù)(surface plasmon resonance,SPR)的G群鏈球菌(Group G Streptococcus,GGS)快速分離檢測(cè)體系。首先通過磁珠(magnetic beads,MBs)表面的不同功能基團(tuán)與抗體分子共價(jià)結(jié)合得到三種功能化IMBs。實(shí)驗(yàn)考察了三種MBs與抗體的結(jié)合能力,結(jié)果表明三種磁珠均能很好地結(jié)合抗體分子,醛基化的磁珠結(jié)合能力最佳;實(shí)驗(yàn)還針對(duì)免疫磁珠分離鏈球菌的效果

4、進(jìn)行了考察,結(jié)果也表明三種免疫磁珠都能特異地分離樣品中GGS,分離效果亦以醛基化的免疫磁珠效果最好。為了對(duì)IMBs分離的GGS進(jìn)行定量分析,本研究聯(lián)合了SPR技術(shù)?；诳贵w分子與GGS的相互作用,在數(shù)十分鐘內(nèi)可以對(duì)菌濃度處于1.0×107CFU/ml-1.0×108CFU/ml范圍內(nèi)的GGS進(jìn)行實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。與其它傳統(tǒng)分離方法相比,本研究所采取的分離方法要簡(jiǎn)便和快速得多,能在一小時(shí)之內(nèi)快速地分離得到目標(biāo)菌。
　　 (2)基于核酸

5、適配體-ATP復(fù)合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用,建立了熒光信號(hào)檢測(cè)腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)新方法。體系優(yōu)化了核酸適配體與ATP結(jié)合反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,核酸適配體與ATP反應(yīng)的最適溫度為12℃;pH值為7.5時(shí),熒光檢測(cè)結(jié)果最靈敏;在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,隨著ATP濃度的減小,所測(cè)得的熒光信號(hào)與空白對(duì)照的變化值變小。由檢測(cè)結(jié)果可知,當(dāng)ATP濃度從10-6mol/L到10

6、-2mol/L變化,對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度隨著濃度的減小而增大,呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。因此可作為該范圍濃度的ATP定量檢測(cè)的依據(jù)。體系還對(duì)該方法的特異性作出了探討,將ATP同類型分子CTP、GTP、UTP作為對(duì)照,根據(jù)檢測(cè)出的結(jié)果可知該核酸適配體對(duì)與ATP分子的檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性。相較于其他的檢測(cè)方法,本研究所建立的基于核酸適配體-ATP特異識(shí)別的熒光檢測(cè)技術(shù),對(duì)于ATP分子的檢測(cè),不僅反應(yīng)體系特異性高,并且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)少,成本低?？梢?

7、本研究為之后的分子識(shí)別和檢測(cè)提供了更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 (3)利用量子點(diǎn)(QD)與金黃色葡萄球菌特異性序列制備了一種功能化QD-DNA探針,基于此探針熒光能量共振轉(zhuǎn)移,建立了一種用于高效檢測(cè)金黃色葡萄球菌16s rDNA的方法。本研究詳細(xì)研究了氨基修飾的DNA與羧基修飾的QD不同比值、不同靶序列濃度等條件對(duì)熒光強(qiáng)度與熒光能量共振轉(zhuǎn)移效率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,熒光強(qiáng)度在羧基修飾的QD與氨基修飾的DNA比值為1:80時(shí)達(dá)到最大值,

8、熒光能量共振轉(zhuǎn)移效率在靶序列為60nM時(shí)趨向于穩(wěn)定并在80nM時(shí)效率最高。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,檢測(cè)系統(tǒng)最低可檢測(cè)至20nM的金黃色葡萄球菌16s rDNA序列,其靈敏度已達(dá)到熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)、DNA傳感器、電化學(xué)線性探針等方法檢測(cè)下限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)該方法具有較強(qiáng)特異性?？傊?此方法具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短、靈敏度及特異性較強(qiáng)等特點(diǎn),為金黃色葡萄球菌的檢測(cè)開辟了一條新的道路。
　　 (4)以核酸適配子與配體的特異性識(shí)別為基礎(chǔ),以金