三重PCR快速檢測嬰幼兒奶粉中的病原菌.pdf

1、食源性疾病是食品安全的主要問題,時刻威脅著人們的健康和生命。在食源性疾病中,細(xì)菌性食物中毒居首位。近年來,阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌等病原菌引起的奶粉中毒事件時有發(fā)生。因此,食源性病原菌的檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個重要的部分。
　　 目前,對食品中病原菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。其中,傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣,檢測時間較長,靈敏度較低;免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度不是很理想:分子生

2、物學(xué)方法特異性較強(qiáng)、檢測時間較短、靈敏度較高。
　　 三重PCR是一種在同一反應(yīng)體系中加入三對特異性引物,同時擴(kuò)增出三條目的DNA片段的擴(kuò)增方法。本文根據(jù)阪崎腸桿菌的外膜蛋白基因ompA、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc、蠟樣芽胞桿菌的溶血素基因hblA設(shè)計了3對特異性引物,進(jìn)行三重PCR反應(yīng),可實(shí)現(xiàn)對阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌三種食源性病原菌的同時檢測。對15株菌進(jìn)行檢測,結(jié)果4株阪崎腸桿菌、2株金黃色葡萄球

3、菌、1株蠟樣芽胞桿菌均擴(kuò)增出了特異性的目的條帶,而另外的8株其它病原菌均無擴(kuò)增條帶。將阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物測序序列在GeneBank上進(jìn)行BLAST比對,同源性均達(dá)到99％以上。試驗(yàn)過程中通過對退火溫度、3對引物、Mg2+、dNTPs、EasyTaqDNAPolymerase等參數(shù)的優(yōu)化,確定了三重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,其反應(yīng)體系為:10×EasyTaqBuffer(-Mg2+)2.5μL,2.5mM

4、dNTPs2.5μL,50mMMgSO41.5μL,10μMompA上下游引物各0.6μL、10μMnuc上下游引物各1.0μL、10μMhblA上下游引物各1.0μL,模板DNA各2μL,5U/μLEasyTaqDNAPolymerase0.3μL,ddH2O補(bǔ)足25μL;反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min;按照94℃45s,61℃45s,72℃45s進(jìn)行30個循環(huán);最后72℃延伸10min。
　　 將阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌

5、、蠟樣芽胞桿菌三種病原菌隨機(jī)組合,均能擴(kuò)增出特異性的目的條帶。在最佳試驗(yàn)條件下,該三重PCR方法同時檢測阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌三種病原菌純培養(yǎng)的靈敏度是103CFU/mL。采用無水乙醇、氨水、石油醚與試劑盒相結(jié)合的方法提取DNA,該三重PCR方法同時檢測阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌三種病原菌在嬰幼兒奶粉中的檢出限是104CFU/g。對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,并將三重PCR方法與國標(biāo)方法進(jìn)行比較,三重PCR方法對阪