實(shí)時定量PCR檢測血中腸道菌DNA及快速藥敏試驗(yàn)的方法研究.pdf

1、本研究的目的是建立利用實(shí)時定量PCR(RQ-PCR)檢測血標(biāo)本中腸道菌DNA的方法并對臨床標(biāo)本進(jìn)行初步檢測，并建立RQ-PCR快速檢測腸道菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對抗生素敏感性的方法，以期能初步了解外科發(fā)熱患者中腸道菌菌血癥的現(xiàn)狀，并建立快速藥敏方法以便有利于指導(dǎo)治療。 在論文第一部分中，選擇脆弱擬桿菌谷氨酰胺合成酶基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立20μl的RQ-PCR反應(yīng)體系，采用含靶基因特異性擴(kuò)增片段

2、的重組質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因組DNA，建立實(shí)時定量PCR.檢測血標(biāo)本中脆弱擬菌DNA的方法學(xué)，并對32份外科發(fā)熱患者的標(biāo)本進(jìn)行了臨床驗(yàn)證。結(jié)果顯示引物和探針特異性好，檢測靈敏度為10<'0>拷貝/μl(10<'3>CFU/ml)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.985～0.999之間。不同濃度的脆弱擬桿菌樣本檢測的平均準(zhǔn)確性為(107.30±2.11)％；批內(nèi)及

3、批間重復(fù)性平均變異系數(shù)(CV)分別為(18.44±1.16)％和(19.00±4.47)％。血標(biāo)本中脆弱擬桿菌DNA平均提取效率為(60.13±5.66)％，提取效率平均變異系數(shù)為(15.62±2.47)％。含有同等量脆弱擬桿菌的臨床血標(biāo)本存放在-20℃或-70℃ 6個月內(nèi)，脆弱擬桿菌DNA拷貝數(shù)差異無顯著性(P=0.467～0.840)，該方法可用于臨床標(biāo)本的脆弱擬桿菌DNA檢測，并具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。 論

4、文第二部分，采用此方法學(xué)對32例外科發(fā)熱患者的84份血標(biāo)本進(jìn)行了實(shí)時定量PCR檢測。結(jié)果顯示10個標(biāo)本檢測到脆弱擬桿菌，陽性率約為11.90％，含量約1.78～9.24×10<'3>CFU/ml，所有患者的血培養(yǎng)結(jié)果均為脆弱擬桿菌陰性。 論文第三部分，在含有相同濃度大腸桿菌的LB液體培養(yǎng)基和血中，分組加入不同的抗生素，并設(shè)立生長對照，分別培養(yǎng)1、2、3、4小時后提取標(biāo)本的基因組DNA，以本研究組先前建立的實(shí)時定量PCR檢測大腸