實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血中金黃色葡萄球菌DNA及快速藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)研究.pdf

1、本研究目的是建立實(shí)時(shí)定量PCR（RQ-PCR）檢測(cè)血標(biāo)本中金黃色葡萄球菌DNA的方法并對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行初步檢測(cè)，并建立RQ-PCR快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對(duì)抗生素敏感性的方法。
在論文第一部分中，選擇金黃色葡萄球菌高度保守的看家基因fem A基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立RQ-PCR反應(yīng)體系，并采用QIAamp（）DNABlood Mini Kit提取基因組DNA。對(duì)26份病人血標(biāo)

2、本和15份模擬血標(biāo)本進(jìn)行RQ-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示特異性好，檢測(cè)限為100拷貝/μl（103CFU/ml），靈敏度為99.7％，特異度為94.6％。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，R2在0.9918～0.9997之間。不同濃度的金黃色葡萄球菌樣本檢測(cè)的平均準(zhǔn)確性為（96.25±2.26）％；批內(nèi)及批間重復(fù)性平均變異系數(shù)（CV）分別為（8.06±0.07）％和（10.01±4.40）％。血標(biāo)本中金黃色葡萄球菌（108～104）DNA平均提取效率為（1

3、11.72±20.72）％，模擬血標(biāo)本陽性率為100％，臨床血標(biāo)本陽性率為15.4％，明顯高于血培養(yǎng)。顯示實(shí)時(shí)定量PCR可用于定量檢測(cè)全血標(biāo)本中金黃色葡萄球菌DNA的含量。
論文第二部分，對(duì)32例外科發(fā)熱患者的84份血標(biāo)本進(jìn)行了RQ-PCR檢測(cè)。27個(gè)標(biāo)本檢測(cè)到金黃色葡萄球菌DNA，陽性率為32.14％，含量約4.36×103～6.39×104CFU/ml，所有患者的血培養(yǎng)結(jié)果均為金黃色葡萄球菌陰性。
第三部

4、分，在含有相同濃度金黃色葡萄球菌的LB培養(yǎng)基和血中，加入不同的抗生素，并設(shè)立生長(zhǎng)對(duì)照，培養(yǎng)1、2、4、6和8小時(shí)后提取標(biāo)本的基因組DNA，以金黃色葡萄球菌特異的fem A基因的引物和TaqMan探針對(duì)標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。培養(yǎng)過程中，耐藥組與生長(zhǎng)對(duì)照組的金黃色葡萄球菌DNA拷貝數(shù)均呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，在LB液體培養(yǎng)基中增長(zhǎng)約2.14～22.82倍，在新鮮全血中增長(zhǎng)約2.20～11.69倍；敏感組金黃色葡萄球菌DNA拷貝數(shù)呈持平或減少趨勢(shì)，