熒光定量PCR檢測(cè)外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞及JAR細(xì)胞的研究.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文熒光定量PCR檢測(cè)外周血中滋養(yǎng)細(xì)胞及JAR細(xì)胞的研究姓名：鄭彤彤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：呂時(shí)銘2001.5.12001年浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)胞，也需要有一個(gè)靈敏的方法檢測(cè)、判斷細(xì)胞數(shù)量的多少。近年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展在外周血中檢測(cè)非血細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的技術(shù)得以迅速發(fā)展。在孕婦外周循環(huán)血中分離檢測(cè)胎兒細(xì)胞是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。一些研究旨在探討從母體循環(huán)血巾獲取胎兒紐胞從而獲取足夠的遺傳信息。用于

2、圍產(chǎn)期胎兒先天√異常的診斷■i木研硝試罔以胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞或JAR細(xì)胞作為分選幾標(biāo)通過熒光定：hLPCR，建立靈敏可靠的在外周血中檢測(cè)胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞或腫稍細(xì)胞的方法。為選擇在母衄中獲取IIf幾細(xì)胞的最佳孕媧1探討妊商征的病因；滋養(yǎng)細(xì)胞腫I盤轉(zhuǎn)移的早期診斷奠定方法學(xué)基礎(chǔ)／，—體課題設(shè)計(jì)在10ml正常人外周血中摻入已知的不同數(shù)量的滋養(yǎng)細(xì)胞或JAR細(xì)胞，建立外周血中檢測(cè)胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托屑t細(xì)胞裂解或密度梯度離心富架后提取總RNA，逆

3、轉(zhuǎn)錄成cDNA。以BhCG基因設(shè)計(jì)的引物及探針作熒光定量PCR，以不同濃度的已知細(xì)胞作橫坐標(biāo)。以通過計(jì)算機(jī)測(cè)得的熒光量(循環(huán)閾值)作縱坐標(biāo)。進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞或JAR細(xì)胞定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞IJAR細(xì)胞數(shù)艟的多少與提取的RNA的多少直接影響FQ—RTPCR的檢出水平，呈正相關(guān)。從105個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞／JAR細(xì)胞提取的mRNA在FQPCR時(shí)只需l3，l6個(gè)循環(huán)(循環(huán)閾值)即可檢測(cè)到探針熒光釋放所形成的典型的S型曲線的起始部，當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞／JAR細(xì)胞的

4、數(shù)量遞減或mRNA量相當(dāng)于10s、104、103、102、10。、100細(xì)胞時(shí)檢測(cè)到探針熒光釋放所需的循環(huán)數(shù)遞增，分別達(dá)到13、16、l7、2l、24、26個(gè)循環(huán)。里良好的線性關(guān)系(JAR細(xì)胞為16、l8、2l、25、26、29個(gè)循環(huán))其靈敏度可達(dá)到檢測(cè)相當(dāng)于1個(gè)滋養(yǎng)細(xì)胞／JAR表達(dá)的BhCGmRNA的量。循環(huán)閱值與細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)里直線相關(guān)(R一099，n=6。P≤001)不同數(shù)量的滋養(yǎng)細(xì)胞摻入外周血后，先經(jīng)紅細(xì)胞裂解再提取RNA作FQP