熒光定量PCR方法檢測嬰兒尿液中人類巨細(xì)胞病毒基因含量.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文熒光定量PCR方法檢測嬰兒尿液中人類巨細(xì)胞病毒基因含量姓名：何蓉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：劉蘭青20000501實(shí)驗(yàn)方法1DNA提?。翰捎贸Ｒ?guī)堿裂解法。2擴(kuò)增反應(yīng)(1)定性PCR擴(kuò)增引物：Pl5’一TGGGCTAACTATGCAGAGCA一3’P。57一AGCCATTGGTGGTCTTAGGG一37反應(yīng)體系20肛1，循環(huán)條件：93。C3分鐘；93“C45秒55“C45秒一72℃60秒，循環(huán)35次；7

2、2oClO分鐘。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，于244bp處出現(xiàn)橙黃色條帶者即判為陽性。(2)FQPCR擴(kuò)增本文應(yīng)用的FQ—PCR方法是雙標(biāo)探針?biāo)獾臒晒舛縋CR方法。此方法在普通PCR方法基礎(chǔ)上，添加了一條標(biāo)記有2個(gè)熒光基團(tuán)的探針。一個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的5r端，稱為熒光報(bào)告基團(tuán)(R)，另一個(gè)標(biāo)記在探針的3’端，稱為熒光抑制基團(tuán)(Q)。兩者構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5’端的熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光可被另一熒光基團(tuán)抑制。探針的3’端羥基已被封閉，不具有延伸能

3、力。探針在無特異性PCR發(fā)生時(shí)，熒光信號(hào)無變化。當(dāng)有特異性PCR發(fā)生時(shí)，探針會(huì)在PCR過程中被Taq酶的5’一37活性作用切斷，抑制作用消失，從而引起報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的增長。熒光信號(hào)伴隨著PCR的進(jìn)行和PCR產(chǎn)物的增長而增長。FQPCR方法就是利用此原理，在PCR過程中，實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)的變化。當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值時(shí)，記錄下此時(shí)的循環(huán)數(shù)(Ct值)，該循環(huán)數(shù)和PCR體系中起始DNA量的對數(shù)值之間有嚴(yán)格的線形關(guān)系，利用陽性標(biāo)準(zhǔn)品