風疹病毒和巨細胞病毒抗體時間分辨熒光免疫定量檢測試劑的研制.pdf

1、背景及目的：
　　風疹病毒和巨細胞病毒都是TORCH篩查的重要組成病毒。風疹是由風疹病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，臨床癥狀輕微，但母體感染風疹病毒可導致嚴重的后果，特別在懷孕的前三個月期間發(fā)生感染，風疹病毒可通過胎盤傳染，并可能導致胎兒死亡或可能會導致嚴重畸形胎兒，通常概括為先天性風疹綜合征(CRS)。CRS是致盲、耳聾、先天性心臟疾病和智力低下的重要原因。巨細胞感染通常是輕微或無癥狀。然而，孕婦懷孕期間巨細胞病毒感染引起宮內傳

2、播的危害性高，可能會導致嚴重的胎兒損傷，包括生長障礙和精神低下，黃疸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常。重癥感染出生患兒臨床上出現(xiàn)嗜睡、驚厥、呼吸窘迫綜合征等，可在數(shù)日或數(shù)周內死亡，幸存者可出現(xiàn)智力障礙、運動障礙、耳聾等后遺癥。巨細胞病毒對血液病患者、腫瘤病人、移植受者、HIV感染者等免疫功能低下者中則可引起嚴重感染，甚至危及生命。
　　IgG、IgM抗體的血清學檢測可初步確定母體的感染情況，IgG抗體產(chǎn)生后可存在數(shù)年或終生，僅IgG陽性提示既往

3、感染，動態(tài)監(jiān)測IgG由陰性轉化為陽性即血清轉化提示近期原發(fā)感染，恢復期血清比急性期血清的抗體滴度有4倍或4倍以上的升高，也可作出近期急性感染的診斷。測定IgG抗體的滴度，還可以了解人群風疹病毒和巨細胞病毒隱性感染水平和考核疫苗的免疫效果。IgM抗體通常在病毒感染后數(shù)天內產(chǎn)生，可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，IgM抗體陽性是病毒急性感染的重要指標。
　　時間分辨熒光免疫法(TRFIA)利用了具有獨特熒光特性的3價稀土離子及其螯合物為示蹤物代替熒光

4、物質、酶、同位素、化學發(fā)光物質等，標記抗體/抗原，待抗原抗體反應發(fā)生后，用TRFIA檢測儀測定反應產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。其中解離增強鑭系熒光免疫分析技術是目前應用最廣泛的時間分辨熒光免疫分析方法，多標記技術則是時間分辨熒光免疫法(TRFIA)的最大亮點。
　　本研究應用時間分辨熒光免疫法（TRFIA）解離增強技術的特點及多標記技術的優(yōu)點，分別研制用于定

5、量檢測風疹病毒IgG抗體，巨細胞病毒IgG抗體，同時檢測風疹病毒和巨細胞病毒IgM抗體的試劑，評價各項性能指標，并與進口試劑進行比較，評價其臨床適用性。
　　方法：
　　1.采用TRFIA“間接法”分別定量檢測人血清中的風疹病毒和巨細胞病毒特異性IgG抗體。
　　1.1 包被特異性抗原:用包被緩沖液分別將風疹病毒抗原和巨細胞病毒抗原稀釋至3μg/mL，按100μL/孔包被至96孔微孔反應板中，經(jīng)封閉、抽干、真空包裝后成

6、特異性反應板，2～8℃貯存。
　　1.2 銪標記羊抗人IgG多克隆抗體:按照5∶1的標記比例，取1mg的羊抗人IgG多克隆抗體進行除雜等預處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Eu充分混合，4℃反應過夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護劑，-20℃貯存。
　　1.3 標準品的制備:用樣本稀釋液分別將混合的高值風疹病毒和巨細胞病毒IgG抗體血清稀釋至10，20，50，100，250IU/mL和

7、5，10，20，40，100 PEIU/mL，經(jīng)校正合格后，2～8℃貯存。
　　2.采用雙標記TRFIA“捕獲法”同時定量檢測人血清中的風疹病毒和巨細胞病毒特異性IgM抗體。
　　2.1 包被抗μ鏈單克隆抗體:用包被緩沖液將抗μ鏈單克隆抗體稀釋至3μg/mL，按100μL/孔包被至96孔微孔反應板中，經(jīng)封閉、抽干、真空包裝后成特異性反應板，2～8℃貯存。
　　2.2 銪標記風疹病毒單克隆抗體:按照5∶1（質量比）的標記

8、比例，取1mg的風疹病毒單克隆抗體進行除雜等預處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Eu充分混合，4℃反應過夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護劑，-20℃貯存。
　　2.3 釤標記鏈霉親和素:按照2∶1（質量比）的標記比例，取0.4mg的鏈霉親和素進行除雜等預處理，濃縮至4～5mg/mL后與0.2mg的DTTA-Sm充分混合，4℃反應過夜，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為0.1％的BSA作為保護劑，-

9、20℃貯存。
　　2.4 巨細胞病毒抗原生物素化:按照1∶25（摩爾比）的標記比例，取1mg巨細胞病毒抗原進行除雜等預處理，濃縮至約2mg/mL后與281μg生物素(NHS-LC-Biotin)充分混合，室溫反應1h，經(jīng)純化處理后，加入終濃度為1mg/mLBSA和0.05％疊氮鈉作為保護劑，-20℃貯存
　　2.5 標準品的制備:用樣本稀釋液分別將混合的高值風疹病毒和巨細胞病毒IgM抗體血清稀釋至2，5，15，40，80 A

10、U/mL和5，20，80，200，400 AU/mL，經(jīng)校正合格后，2～8℃貯存。
　　3.試劑性能指標的評價
　　3.1 陰性/陽性參考品符合率:檢測商用血清盤（PTR201或PTC203）和國家血清盤，計算符合率。
　　3.2 劑量-反應曲線:以參考標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，各濃度點信號值減去本底信號值的對數(shù)為縱坐標，由雙對數(shù)數(shù)學模型Log-Log函數(shù)處理。
　　3.3 分析靈敏度:以零參考標準品測定值的均值

11、加上2倍的標準差所得信號值減去本底信號值，代入標準曲線方程計算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　3.4 線性:將濃度值為高、低的血清樣本按系列倍比稀釋后進行檢測，將結果平均值和稀釋比例用最小二乘法進行直線擬合，計算相關系數(shù)r。
　　3.5 回收率實驗:在特異性抗體常規(guī)檢查樣本中，加入相同體積不同濃度的特異性抗體標準液，制備回收樣本，計算回收率。
　　3.6 精密度實驗:在不同的時間三次實驗中，測定不同濃度的陽性血清樣本

12、（高、中、低），分別計算一次實驗的分析內變異系數(shù)和三次實驗的分析間變異系數(shù)。
　　3.7 交叉反應:選擇可能會對目的抗體發(fā)生交叉反應的樣本進行檢測。
　　3.抗干擾實驗:對加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽性標本進行測定，比較樣本添加干擾物前、后的濃度變化。
　　3.9 與進口試劑比對實驗:自制試劑與進口對照試劑平行檢測樣本濃度后，使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析。
　　結果：
　　1.自制風疹病

13、毒IgG抗體檢測試劑，分析靈敏度為0.12 IU/mL，檢測范圍達0.12～250 IU/mL，準確度高，檢測回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內，分析內和分析間精密度均＜10％。與進口試劑進行平行比對實驗，特異性符合率為:97.10％(67/69)，敏感性符合率為:99.42％(340/342)，經(jīng)配對卡方檢驗，P=1.000，表明兩種檢測方法無顯著差異;結合κ系數(shù)檢驗，κ=0.965，P=0.000，說明兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)

14、計學意義且較強。
　　2.自制巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑，分析靈敏度為0.18 PEIU/mL，檢測范圍達0.18～100 PEIU/mL，準確度高，檢測回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內，分析內和分析間精密度均＜10％。與進口試劑進行平行比對實驗，臨床特異性符合率為:95.35％(41/43)，臨床敏感性符合率為:100.00％(368/368)，經(jīng)配對卡方檢驗，P=0.500，表明兩種檢測方法無顯著差異;結合κ系數(shù)檢

15、驗，κ=0.973，P=0.000，說明兩種檢測方法吻合度有統(tǒng)計學意義且較強。
　　3.自制雙標記風疹病毒/巨細胞病毒IgM抗體檢測試劑，分析靈敏度分別為0.15AU/mL、1.12AU/mL，檢測范圍分別為0.15～80.00AU/mL、1.12～400.00AU/mL，準確度高，檢測回收樣本的回收率均在90％～110％范圍內，分析內和分析間精密度均＜10％。與進口試劑進行平行比對實驗，臨床特異性符合率分別為:99.15％(35

16、2/355)、98.27％(340/346)，臨床敏感性符合率分別為:96.43％(54/56)、93.85％(61/65)，經(jīng)配對卡方檢驗，P風疹=1.000、P巨細胞=0.754，表明兩種檢測方法均無顯著差異;結合κ系數(shù)檢驗，κ風疹=0.949、P風疹=0.000;κ巨細胞=0.910、P巨細胞=0.000，說明兩種檢測方法吻合度均有統(tǒng)計學意義且較強。
　　結論：
　　本研究利用時間分辨熒光免疫分析技術，成功開發(fā)了三個定

17、量檢測試劑，可以應用于檢測人血清中的風疹病毒IgG抗體、風疹病毒IgM抗體、巨細胞病毒IgG、巨細胞病毒IgM抗體共四種不同的血清標志物。經(jīng)評價，試劑的靈敏度高、準確度好、檢測范圍寬、精密度和特異性等各項性能指標均符合要求;與同類商業(yè)化進口試劑比較，其臨床特異性和敏感性均無顯著差異，達到了臨床檢測試劑的要求。特別是雙標記風疹病毒/巨細胞病毒IgM抗體檢測試劑，可以在一次實驗中同時檢測兩種不同的血清標志物，極大地減少了臨床檢測的工作量，具