人巨細(xì)胞病毒UL148抗體檢測(cè)試劑盒的研制及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　在前期關(guān)于人巨細(xì)胞病毒（HCMV）臨床病毒株UL148基因結(jié)構(gòu)功能系列研究的基礎(chǔ)上，制備UL148抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，明確該功能基因的優(yōu)勢(shì)抗原表位，建立檢測(cè)HCMV UL148抗體的方法，優(yōu)化檢測(cè)體系，進(jìn)行靈敏性與特異性的評(píng)價(jià)，觀察不同臨床表型與檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。探討HCMV臨床病毒株UL148抗體檢測(cè)試劑盒的開發(fā)與應(yīng)用的前景。
　　方法：
　　1.以課題組前期研究為基礎(chǔ)，將應(yīng)用

2、生物信息學(xué)方法篩選的重復(fù)性好、抗原指數(shù)高的3條多肽（P1、P2、P3）作為HCMV UL148基因候選B細(xì)胞表位，本課題通過化學(xué)合成3條抗原多肽及免疫動(dòng)物方法，獲取免疫兔血清制備多克隆抗體，應(yīng)用Western Blot鑒定HCMV UL148抗體，確定HCMV UL148 B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。
　　2.化學(xué)合成UL148 B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位作為包被抗原，通過方陣滴定法選擇包被抗原和血清樣本的最佳工作濃度，通過連續(xù)稀釋法確定酶標(biāo)二抗

3、的最佳工作濃度，然后包被酶標(biāo)板制作試劑盒，建立檢測(cè)HCMV臨床病毒株UL148抗體的方法。
　　3.以經(jīng)廣東省婦幼保健院臨床確診為CMV性肺炎或CMV性肝炎及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HCMV陽性的血清標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，以未感染HCMV的正常健康兒童作為陰性對(duì)照組，應(yīng)用HCMV UL148抗體檢測(cè)試劑盒分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)；通過RT-PCR鑒定UL148基因的表達(dá)，研究HCMV UL148抗體檢測(cè)試劑盒的靈敏性及特異性。
　　4.將實(shí)驗(yàn)組分別按年

4、齡、性別、病種、肝酶學(xué)指標(biāo)、HCMV-IgM值分組，分析HCMV UL148抗體檢測(cè)情況，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HCMV UL148表達(dá)在各組中的差異，觀察不同臨床表型與UL148抗體陽性的相關(guān)性，明確HCMV UL148的臨床意義。
　　結(jié)果：
　　1. P1(HCMV UL148265-275)、P2（HCMV UL14818-25）、P3（HCMV UL148221-229）三條多肽均能免疫兔子產(chǎn)生抗體，且抗體效價(jià)隨著免疫

5、次數(shù)增加而升高。經(jīng)Western Blot鑒定，證實(shí)僅P3段多肽免疫獲得抗體能與臨床病毒株HCMV UL148蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，成為HCMV UL148 B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位。
　　2.確定包被抗原P3（1mg/ml）最佳稀釋度為1：160，血清樣本最佳稀釋度為1：100，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1：6000，優(yōu)化了檢測(cè)體系，建立了檢測(cè)HCMV UL148抗體的方法。
　　3.共收集標(biāo)本67例，其中實(shí)驗(yàn)組52例，對(duì)照組15例，

6、當(dāng)臨界值為0.246時(shí)，52例感染HCMV患兒血清用UL148抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出陽性例數(shù)為22例，陰性為30例；15例未感染HCMV的健康兒童血清中用UL148抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出陽性例數(shù)為0例，陰性例數(shù)為15例；HCMV-UL148抗體檢測(cè)試劑盒的靈敏性為81.5％，特異性為100%。
　　4.將實(shí)驗(yàn)組按年齡、性別、病種、肝酶學(xué)指標(biāo)、HCMV-IgM值分組，分析使用HCMV UL148抗體檢測(cè)試劑盒的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：≤3月齡組UL

7、148抗體陽性檢出數(shù)高于3-12月齡組，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩組檢查結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CMV性肝炎組UL148抗體陽性檢出數(shù)高于CMV肺炎組，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩組檢查結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；UL148抗體陽性組肝酶學(xué)AST、ALT、GGT三項(xiàng)指標(biāo)均高于UL148抗體陰性組，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；按性別及IgM值等分組UL148抗體陽性檢出率無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)免疫動(dòng)物及Western

8、 Blot鑒定，確定了P3為HCMV UL148 B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，可作為UL148抗體檢測(cè)試劑盒的包被抗原。
　　2.本課題通過確定HCMV UL148B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，建立了檢測(cè)HCMV UL148抗體的方法，確立了優(yōu)化檢測(cè)體系，進(jìn)行了靈敏性與特異性的評(píng)價(jià)，具有開發(fā)研制成人巨細(xì)胞病毒UL148抗體檢測(cè)試劑盒的前景。
　　3.(1) HCMV UL148基因的表達(dá)可能與年齡有關(guān)，3月齡內(nèi)感染HCMV的患兒其UL148基