基因工程人巨細(xì)胞病毒PP150抗原試劑盒的制備及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的： 原發(fā)性人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)孕期感染胎兒80％可出現(xiàn)智力低下，視力、聽(tīng)力損傷，嚴(yán)重者引起流產(chǎn)、死胎。免疫抑制患者感染HCMV可導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎，死亡率高達(dá)75％。孕期活動(dòng)感染可導(dǎo)致胎兒畸形，因此HCMV早期檢測(cè)具有重要的臨床意義。 臨床上診斷HCMV早期和近期感染主要依據(jù)ELASA檢測(cè)IgM抗體，檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性和特異性決定著檢測(cè)結(jié)果的可靠性，因此要求所包被的抗原具有抗原性強(qiáng)、特異性好的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)臨床采用的

2、試劑盒基本為國(guó)產(chǎn)試劑，一般用細(xì)胞增殖病毒的方法獲取抗原。由于病毒生長(zhǎng)和抗原表達(dá)的差異，再加上混有成纖維細(xì)胞成分，易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致和假陽(yáng)性。 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因工程抗原逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗原廣泛的應(yīng)用于各種檢測(cè)?；蚬こ炭乖Y(jié)構(gòu)單純，性質(zhì)穩(wěn)定在檢測(cè)中可以避免提高反應(yīng)的敏感性，特異性，穩(wěn)定性并且易于標(biāo)準(zhǔn)化，更為安全。但由于一直未能找到具有較強(qiáng)的IgM反應(yīng)原性和特異性的抗原，檢測(cè)HCMV的ELISA試劑國(guó)內(nèi)一直沒(méi)有被基因工程

3、抗原完全取代。 該項(xiàng)研究的主要目的是用基因工程方法表達(dá)HCMV抗原性較強(qiáng)并且具有IgM特異性反應(yīng)的蛋白片段，以重組抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒檢測(cè)抗原，以提高檢測(cè)的特異性，敏感性，降低檢測(cè)成本，促進(jìn)病毒檢測(cè)的發(fā)展。 方法： 根據(jù)genebank所查的HCMVPP150基因和相關(guān)文獻(xiàn)選取IgM特異性反應(yīng)的基因片斷，全基因合成后構(gòu)建克隆載體，PCR擴(kuò)增目的基因，將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pET-30a載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選

4、。對(duì)陽(yáng)性菌落測(cè)序后將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21菌株IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)，用westen方法鑒定蛋白抗原性，純化抗原用交叉連續(xù)稀釋分析法滴定抗原滴度，然后包被酶標(biāo)板制作試劑盒，與傳統(tǒng)抗原制做的試劑盒、PCR試劑盒比較其陽(yáng)性符合率、陰性符合率，并用新制作的試劑盒對(duì)獻(xiàn)血員血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，初步分析了濟(jì)南地區(qū)血庫(kù)供血HCMV污染概況。 結(jié)果： 1、工程菌表達(dá)的目的蛋白具有預(yù)期抗原活性。 2

5、、用基因工程抗原制做的試劑盒與傳統(tǒng)抗原制作的試劑盒比較：陽(yáng)性符合率80％，陰性符合率96.67％；與PCR試劑盒比較：陽(yáng)性符合率96.67％，陰性符合率86.67％。基因工程抗原制做的試劑盒與PCR試劑盒有較高的陽(yáng)性符合率，比傳統(tǒng)抗原制作的試劑盒特異性較高。表明基因工程抗原試劑盒敏感特異。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明研究建立的試劑盒穩(wěn)定可靠，易于4℃長(zhǎng)期存放、相對(duì)較高溫度的短期存放(如運(yùn)輸?shù)?，利于推廣使用。 3、濟(jì)南地區(qū)獻(xiàn)血員HCMV感