食品中常見病原菌快速檢測系統(tǒng)的研究——自制裸磁珠吸菌性能研究和實時熒光PCR檢測副溶血性弧菌方法的建立.pdf

1、目的：研究自制裸磁珠對常見食源性致病菌的吸附性能；建立TaqMan-實時熒光PCR快速檢測副溶血性弧菌的方法，用于食物中毒快速診斷和食品中副溶血性弧菌的污染狀況調(diào)查。 方法： 第一部分自制裸磁珠吸菌性能研究 1．磁珠對低菌量菌液的吸附與濃集的研究 研究磁珠對低菌量細(xì)菌的吸附性能、溫度對磁珠吸附性能的影響及磁珠對樣品中細(xì)菌的吸附性能。 2．磁珠對高菌量菌液的吸附與濃集的研究 研究高菌量時磁珠

2、對實驗菌的吸附方法、干式和濕式磁珠對細(xì)菌的吸附性能、不同磁珠用量對細(xì)菌的吸附、原始菌量對磁珠吸附容量的影響、不同孵育時間對實驗菌的吸附以及不同孵育溫度對實驗菌的吸附情況。 第二部分TaqMan-實時熒光PCR快速檢測副溶血性弧菌方法的建立 1.引物和探針設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中副溶血性弧菌tdh基因的保守序列設(shè)計引物和探針，并提交BLASTN進行比對，探討其代表性。 2.TaqMarr-實時熒光P

3、CR檢測 檢測菌方法的建立與反應(yīng)條件優(yōu)化建立基于TaqMan-實時熒光PCR快速檢測副溶血性弧菌反應(yīng)體系并進行反應(yīng)條件優(yōu)化以及靈敏度、特異性試驗。 3.未知菌量菌液濃度測定 以模板菌濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量測定未知菌量的副溶血性弧菌。 結(jié)果： 1.自制裸磁珠對低菌量菌液吸附：37℃對常見食源性致病菌和衛(wèi)生指示菌有很強的吸附，吸附率達到97％。食品成分對其吸附有一

4、定影響，吸附率最低為58.42％。 2.自制裸磁珠對高菌量菌液吸附：磁珠用量與吸附率近似正相關(guān)，吸附容量與原始菌量存在對數(shù)線性相關(guān)。溫度影響吸附效率。吸附作用40min后吸附率無明顯差異，達到平衡。此外，干式和濕式保存的磁珠，對試驗細(xì)菌的吸附率無明顯差異。 3.TaqMan-實時熒光PCR快速檢測體系靈敏度高，能達到1.3×10<'4>cfu/ml(33cfu/PCR反應(yīng)體系)，對8株攜帶tdh基因的副溶血性弧菌能檢測到

5、熒光信號，而對其它弧菌菌株則檢測不到熒光信號，無交叉反應(yīng)，特異性好，可用于食物中毒快速診斷和食品中副溶血性弧菌的污染狀況調(diào)查。 結(jié)論： 磁分離技術(shù)不僅能快速吸附和濃集細(xì)菌，而且能同時吸附多種目的菌，通過實驗自制裸磁珠對不同菌量的菌液都有比較理想的吸附。實時熒光PCR技術(shù)的快速定量檢測是其它檢測方法無法比擬的，其較低的檢出限、良好的特異性和實驗時間短是這一技術(shù)的主要特點，用于副溶血性弧菌的快速檢測靈敏度較高，特異性強，可用