糖基化修飾對(duì)抗腫瘤藥物生物活性影響的研究.pdf

1、隨著糖生物學(xué)的迅猛發(fā)展，以糖生物學(xué)研究為基礎(chǔ)的糖藥物，包括糖類、糖基化修飾的蛋白質(zhì)，脂類和化學(xué)小分子藥物及其和酶相互作用的化合物，已成為新藥開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域。為了探討糖基化修飾對(duì)糖蛋白藥物和化學(xué)藥物生物活性的影響，本課題選用人重組干擾素β(rhIFNβ)、α-Gal(Galα1，3Gal)修飾的表皮生長(zhǎng)因子受體HER2的單克隆抗體-α-Gal-Herceptin和新型NO供體半乳糖基化二醇二氮烯翁-β-Gal-NONO-ate作為研究對(duì)象

2、，探討糖基化修飾的藥物分子的作用機(jī)理和意義。為新藥品的設(shè)計(jì)和原有藥品的改造提供新的思路和理論依據(jù)；從而達(dá)到增加藥物的靶向性、有效地降低藥物的毒副作用、使藥物在體內(nèi)表現(xiàn)為最佳活性狀態(tài)、降低藥物的用量和成本等目的。
　　 1.rhIFNβ在dhfr--CHO中的高效表達(dá)采用PCR技術(shù)從pLG104R載體中擴(kuò)增目的基因，經(jīng)XhoⅠ和SmaⅠ酶切后克隆到真核表達(dá)載體pCI-dhfr中；采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到dh

3、fr--CHO細(xì)胞中；通過(guò)氨甲喋呤(metlliomine sulphoximine，MTX)加壓篩選，以細(xì)胞病變抑制(cell pathological effect inhibition，CPEI)法定量檢測(cè)培養(yǎng)上清中表達(dá)產(chǎn)物的生物活性，將高效表達(dá)rhIFNβ的CHO細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)；經(jīng)Blue Sepharose和CM Sepharose柱層析分離純化，以20％的聚乙二醇(PEG)6000透析濃縮、以?shī)A心ELISA和Western-

4、blotting定量并鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了rhIFNβ真核表達(dá)載體pCI-dhfr-ifnβ，確定了MTX的最佳篩選濃度為500 nmol·L-1，獲得了穩(wěn)定高效表達(dá)rhIFNβ的dhfr--CHO細(xì)胞株(9.3×105 IU/106cells·mL-1)，純化濃縮后所得產(chǎn)物的比活性為2.27×107IU·m-1。為填補(bǔ)我國(guó)無(wú)自主生產(chǎn)CHO細(xì)胞表達(dá)的rhIFNβ空白奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.不同表達(dá)體系生產(chǎn)的rhI

5、FNIβ的生物活性比較采用CPEI和MTT法比較E.coli、Yeast和CHO細(xì)胞表達(dá)體系所生產(chǎn)的rhIFNβ的體外抗病毒和抗腫瘤活性；以人肺腺癌A549細(xì)胞接種的BALB/c裸鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)瘤重的變化，比較三種不同來(lái)源的rhIFNβ對(duì)荷瘤小鼠的治療效果。結(jié)果表明，在100 ng·mL-1在濃度下，由CHO細(xì)胞表達(dá)的rhIFNβ，其體外抗病毒活性和抗增值活性顯著高于其他兩個(gè)表達(dá)體系；在E.coli、Yeast和CHO細(xì)胞表達(dá)體

6、系所生產(chǎn)的rhIFNβ對(duì)荷瘤小鼠的治療中，瘤重降低的比率分別是：16％、33.3％和50.6％。因此，rhIFNβ在動(dòng)物體內(nèi)的生物活性為：CHO細(xì)胞>Yeast>E.coli。結(jié)果提示，糖蛋白糖形結(jié)構(gòu)越接近天然狀態(tài)，其生物活性就越高；同時(shí)，也顯示了以CHO細(xì)胞為生產(chǎn)平臺(tái)表達(dá)糖蛋白藥物的優(yōu)越性。
　　 3.半乳糖基化NO供體-β-Gal-NONOate的靶向胞內(nèi)釋放及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用糖基化是改善化學(xué)藥物的水溶性、穩(wěn)定性、靶向

7、性及生物活性的有效手段。以具有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性C6/LacZ胞和無(wú)β-半乳糖苷酶活性的C6細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肎riess法比較β-Gal-NONOate-與NONOate分別在C6/LacZ和C6細(xì)胞中NO的釋放量；通過(guò)細(xì)胞集落形成、臺(tái)盼藍(lán)拒染和MTT法比較β-Gal-NONOateNONOate對(duì)上述腫瘤細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明，β-Gal-NONOate與C6/LacZ細(xì)胞中NO的釋放量呈劑

8、量依賴關(guān)系，并在相同藥物濃度條件下明顯高于NONOate(P<0.01)；然而，在不表達(dá)β-半乳糖苷酶的C6細(xì)胞中比較穩(wěn)定；β-Gat-NONOate對(duì)C6/LacZ細(xì)胞的毒性作用(IC50為5 mmol·L-1)明顯高于NONOate(IC50為10 mmol·L-1)(P<0.05)，但對(duì)C6細(xì)胞則沒(méi)有明顯的抑制作用；NONOate在C6/LacZ和C6細(xì)胞中的NO釋放量和對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞系的作用效果都沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果

9、提示，β-Gal-NONOate在癌細(xì)胞中釋放NO和對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用依賴于細(xì)胞對(duì)β-半乳糖苷酶的表達(dá)，因此對(duì)表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞具有靶向性；而NONOate對(duì)細(xì)胞是否表達(dá)β-半乳糖苷酶沒(méi)有選擇性。
　　 4.β-Gal-NONOate對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)的研究采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法，將真核表達(dá)載體pcDNA3-LacZ轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中；經(jīng)G418(400 mg·mL-1)篩選，以5-溴-4-氯-3-吲哚-D-

10、半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)法進(jìn)行β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性檢測(cè)，獲得穩(wěn)定表達(dá)β-半乳糖苷酶的HeLa/LacZ細(xì)胞株；采用LDH法、DNA梯度電泳和形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)β-Gal-NONOate對(duì)HeLa/LacZ細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)；以MTT法比較β-Gal-NONOate和NONOate對(duì)HeLa/LacZ和HeLa細(xì)胞的

11、毒性作用。結(jié)果表明，β-Gal-NONOate可明顯誘導(dǎo)HeLa/LacZ細(xì)胞發(fā)生凋亡，在0-5 mmol·L-1濃度范圍內(nèi)，呈劑量依賴關(guān)系；熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)凋亡小體的形成，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)凋亡典型的DNA梯形條帶；MTT結(jié)果顯示，β-Gal-NONOate(5 mmol·L-1)對(duì)HeLa/LacZ細(xì)胞的毒性明顯高于NONOate(P<0.05)，而對(duì)未轉(zhuǎn)染LacZ基因的HeLa細(xì)胞的毒性作用與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異(P>0.05)

12、；NONOate對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系的抑制效應(yīng)沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。結(jié)論β-Gal-NONOate可通過(guò)β-半乳糖苷酶的表達(dá)誘導(dǎo)HeLa/LacZ細(xì)胞的凋亡。
　　 5.α-Gal修飾的Herceptin增強(qiáng)人血清對(duì)乳腺癌細(xì)胞毒性作用的研究以過(guò)表達(dá)HER2的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用流式?xì)胞術(shù)檢測(cè)由α-Gal-Herceptin介導(dǎo)的anti-Gal與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合率；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法和LDH活性測(cè)定法

13、，比較α-Gal-Herceptin與Herceptin對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明，人血清中的α-Gal抗體在α-Gal-Herceptin的引導(dǎo)下，能夠特異性地靶向SK-BR-3胞；當(dāng)以人血清作為α-Gal抗體和補(bǔ)體來(lái)源時(shí)，α-Gal-Herceptin通過(guò)Herceptin對(duì)癌細(xì)胞表面HER2的識(shí)別，包被在SK-BR-3細(xì)胞表面，增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)人血清的敏感性，即α-Gal-Herceptin對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的毒性作