高良姜素的結(jié)構(gòu)修飾與抗腫瘤活性研究.pdf

1、2008年，GLOBOCAN報(bào)告指出乳腺癌是中國(guó)女性死于癌癥的第6位死因，ASR為5.7/10萬(wàn)女性，排在肺癌、胃癌、肝癌、食管癌和結(jié)直腸癌之后。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明：近40年國(guó)內(nèi)外乳腺癌的發(fā)病率，每年都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，在我國(guó)表現(xiàn)出特別明顯。乳腺癌也已成為困擾中國(guó)女性的的一大疾病，對(duì)乳腺癌的研究也是近年來(lái)研究的重點(diǎn)之一。目前臨床應(yīng)用的抗乳腺癌藥物大多毒副作用較大，存在一定的耐藥性，因此，如何尋找療效更好，毒性更低的新穎的抗腫瘤藥物，一直是藥物

2、化學(xué)家努力的方向。從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)或以天然產(chǎn)物為底物開發(fā)新穎的抗腫瘤藥物是一種行之有效的途徑。
　　高良姜素（galangin，3,5,7-三羥基黃酮），是一種天然來(lái)源的黃酮醇類化合物，主要分布于我國(guó)傳統(tǒng)中藥高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根莖中，具有廣泛的藥理作用?，F(xiàn)代研究表明高良姜素能夠抑制肝癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，被認(rèn)為是一種具有良好開發(fā)和應(yīng)用前景的天然化學(xué)預(yù)防藥物。
　　

3、然而，目前尚未有關(guān)于高良姜素結(jié)構(gòu)修飾的研究報(bào)道。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其化學(xué)結(jié)構(gòu)母核與抗腫瘤活性顯著的Flavopiridol類似。Flavopiridol是一種廣泛的CDKs抑制劑，具有廣泛的抗腫瘤活性，目前已經(jīng)進(jìn)入了三期臨床試驗(yàn)。構(gòu)效關(guān)系研究表明，黃酮母核上含氮原子哌啶 D環(huán)的存在以及位置對(duì)CDKs抑制活性影響巨大，當(dāng)哌啶環(huán)被環(huán)己烷取代活性大大下降，母核的5，7位羥基對(duì) CDKs抑制活性至關(guān)重要。對(duì)比高良姜素和Flavopiridol結(jié)構(gòu)分析

4、，發(fā)現(xiàn)前者結(jié)構(gòu)中缺失CDKs的抑制活性基團(tuán)即D環(huán)羥基哌啶氮環(huán)。這一現(xiàn)象提示我們，利用化學(xué)合成的手段引入含氮原子D環(huán)可望增強(qiáng)高良姜素對(duì) CDKs的抑制作用，以期尋找結(jié)構(gòu)優(yōu)化的CDKs抑制劑，這對(duì)于充分利用高良姜植物資源，為開發(fā)新型的抗腫瘤藥物提供可能。
　　鑒于此，本論文第一部分運(yùn)用 Mannich反應(yīng)對(duì)高良姜素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)、合成了6個(gè)含氮高良姜素衍生物（GS-a~GS-f），利用紅外光譜、質(zhì)譜與核磁共振氫譜對(duì)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)

5、表征，確定了結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。此外，采用MTT法對(duì)結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物進(jìn)行了初步的抗腫瘤活性篩選，結(jié)果表明：與底物高良姜素進(jìn)行比較，部分化合物顯示出了比高良姜素更好的抗腫瘤活性，其中GS-a與GS-c對(duì)MGC-803，GS-d對(duì)A549與Hela，GS-e對(duì)A875、PC-3，GS-f對(duì)PC-3、MGC-803的活性均優(yōu)于高良姜素。引入的基團(tuán)起到了增強(qiáng)活性的作用。
　　前期研究表明，高良姜素能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，顯著抑制MCF-7

6、細(xì)胞增殖抑制，然而作用機(jī)制不明確。因此，本論文第二部分從與凋亡相關(guān)的線粒體途徑和 Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)信號(hào)表達(dá)的變化深入研究高良姜素誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。采用CCK-8法研究了高良姜素對(duì)MCF-7增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高良姜素能顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)一定的濃度依賴關(guān)系，24 h和48 h的IC50分別為43.71μmol/L和20.68μmol/L；采用Hoechst33258染色和

7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了高良姜素誘導(dǎo)MCF-7凋亡作用，結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察到藍(lán)色梅花狀凋亡小體，表明高良姜素可以誘導(dǎo) MCF-7凋亡，160μmol/L時(shí)凋亡率為36.46％，并呈現(xiàn)出濃度依賴關(guān)系。PI單染法檢測(cè)高良姜素對(duì)MCF-7細(xì)胞周期阻滯情況，結(jié)果表明高良姜素對(duì)MCF-7周期影響作用比較復(fù)雜，不同濃度的高良姜素對(duì)周期影響有差異，當(dāng)高良姜素濃度在0~40μmol/L，高良姜素將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，隨著藥物濃度升高，在40~160μ

8、mol/L濃度范圍內(nèi)高良姜素對(duì)G2/M期阻滯作用逐漸減弱，而對(duì)S期阻滯作用加強(qiáng)。采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)了p-PI3K、p-Akt、Cyclin D3、Cyclin B1、cleaved-Bid、Bad、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量,結(jié)果不同濃度高良姜素處理 MCF-712小時(shí)后， cleaved-Bid、Bad、Ba

9、x、cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-8、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)量上升，Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Cyclin D3、Cyclin B1蛋白表達(dá)量下降。以上結(jié)果提示，高良姜素通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞凋亡，阻滯 MCF-7細(xì)胞周期，抑制 PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制MCF-7細(xì)胞增殖。
　　綜上所述，本文采用半合成方法對(duì)高良姜素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得