N糖基化修飾對B7-H3生物學(xué)功能影響的初步研究.pdf

1、 碩士學(xué)位論文 論文題目 N 糖基化修飾對 B7-H3 生物學(xué)功能影響 的初步研究 研究生姓名 石小蕊 指導(dǎo)教師姓名 周迎會 專業(yè)名稱 生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研究方向 信號分子與糖基化相關(guān)性研究 論文提交日期 2013 年 4 月 N 糖基化修飾對 糖基化修飾對 B7-H3 生物學(xué)功能影響的初步研究 生物學(xué)功能影響的初步研究 中文摘要 中文摘要

2、 I 中文摘要 目的 蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，它參與并調(diào)控了許多關(guān)鍵的生命活動，且與許多疾病的發(fā)生有關(guān)，因此越來越受到廣泛的重視。 B7-H3 是共刺激分子家族中一個新成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白。2IgB7-H3是 B7-H3 在人體內(nèi)剪接體之一，其氨基酸序列上有 4 個 N-糖基化修飾位點(diǎn)和 1 個O-糖基化修飾位點(diǎn)，ProtParam 軟件預(yù)測計算其分子量為 33.7Kd,而實(shí)際分子量為55Kd，推測糖基化約占其分子量的

3、 38%，如此高度的糖基化修飾可能與 B7-H3 的功能有關(guān)。 B7-H3 在很多腫瘤細(xì)胞中都有高表達(dá)，在不同腫瘤細(xì)胞中功能不盡相同，可能是一個腫瘤抗性的調(diào)控因子。B7-H3 在胃癌細(xì)胞中有較高的陽性表達(dá)率，其表達(dá)與患者生存期、腫瘤浸潤程度、組織類型相關(guān)。胃癌細(xì)胞中 B7-H3 能夠促進(jìn)β3GnT8 和多聚乳糖胺糖鏈表達(dá)， 生物信息學(xué)模擬 B7-H3 和 β3GnT8 蛋白三維結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)二者能夠空間對接。 本文基于已構(gòu)建好的 2IgB

4、7-H3 重組載體，利用快速定點(diǎn)突變方法構(gòu)建去 N-糖基化 2IgB7-H3-mut 真核表達(dá)載體， 并將其穩(wěn)定表達(dá)于人胃癌細(xì)胞 SGC-7901 中，初步觀察 B7-H3 糖基化與否對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。 方法 1.利用快速定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建 2IgB7-H3 去 N-糖基化突變表達(dá)載體pIRES2-EGFP/2IgB7-H3-mut。 2.利用脂質(zhì)體將空表達(dá)載體、 正常及去 N-糖基化的 2IgB7-H3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)

5、胞 SGC-7901 中，經(jīng) G418 篩選獲得 2IgB7-H3 去 N-糖基化前、后的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 SGC-7901/2IgB7-H3、 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 以及空載體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 SGC-7901/mock。 3.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測 SGC-7901/2IgB7-H3-mut 相對于 SGC-7901/2IgB7-H3、SGC-7901/mock 細(xì)胞周期的差異； 利用 MTT 法檢測 SGC-7901