IL-10受體基因多態(tài)性及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人SLE發(fā)病關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一個(gè)可累及全身多個(gè)系統(tǒng)的慢性炎癥性自身免疫性疾病。SLE臨床表現(xiàn)各異,可累及皮膚、粘膜、關(guān)節(jié)、腎臟、肺、心臟、血液系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)。SLE病因不清,可能與遺傳、性激素、感染及環(huán)境、機(jī)體免疫異常等多種因素有關(guān)。目前一般認(rèn)為SLE的發(fā)病是激素和環(huán)境因素觸發(fā)了具有遺傳易感性的個(gè)體發(fā)生了免疫異常,最終導(dǎo)致各個(gè)臟器損傷。白細(xì)胞介素10

2、(Interlukin-10,IL-10)是Th2類(lèi)細(xì)胞因子,抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、INF-α,等細(xì)胞因子,抑制單核細(xì)胞活化及分泌細(xì)胞因子,具有免疫抑制作用;然而IL-10還可以促進(jìn)人B細(xì)胞增殖并分化為分泌抗體的細(xì)胞,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化,又具有免疫刺激作用。近年的研究證實(shí)IL-10參與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化和功能。Llorente等最早描述了SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononucle

3、ar cells,PBMC)IL-10mRNA表達(dá)增高,而健康對(duì)照表達(dá)較少。后續(xù)的多個(gè)研究證實(shí)了IL-10mRNA和蛋白在SLE患者PBMCs中表達(dá)增高,而且?guī)缀跛袦y(cè)定血清IL-10水平的研究均支持IL-10與SLE疾病活動(dòng)性相關(guān)。但是其作用機(jī)制還不明確,多數(shù)研究證明IL-10促進(jìn)SLE發(fā)生發(fā)展,也有的試驗(yàn)表明IL-10在SLE發(fā)病中具有保護(hù)作用。所以我們假設(shè)IL-10受體在SLE中可能有異常,導(dǎo)致IL-10作用的不一致性。
　

4、　 IL-10必須與其特異性受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。功能性的IL-10受體包括四個(gè)亞單位,兩個(gè)與配體特異性結(jié)合的α鏈(Interlukin-10 receptora,IL-10R1)和兩個(gè)輔助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的β鏈(Interlukin-10 receptorβ,IL-10R2)。IL-10與IL-10R1結(jié)合后,經(jīng)JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)向細(xì)胞內(nèi)傳遞興奮性或抑制性信號(hào)。對(duì)小鼠IL-10R1基因編碼區(qū)序列進(jìn)行的DNA序列分析顯示,狼瘡模型小

5、鼠NZW和MRL/1pr小鼠的IL-10R1基因共同存在多處變異,而非狼瘡鼠則無(wú)相關(guān)變異,提示IL-10R1可能是一個(gè)狼瘡易感基因。最近有研究表明,在歐洲白人中IL10R1有意義多態(tài)性位點(diǎn)G330R在SLE患者和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中分布增高,提示其可能與SLE易感性有關(guān)。
　　 關(guān)于IL-10R在SLE中表達(dá)情況及功能方面的研究較少,2003年Cairns AP等檢測(cè)了SLE、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及正常對(duì)照者外周血白細(xì)胞表面IL-10

6、R1表達(dá)情況,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)3組之間IL-10R表達(dá)有差異。Valencia-Pacheco G等用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了19例SLE患者和15例健康對(duì)照PBMCs的IL-10R表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患者和健康對(duì)照IL-10R表達(dá)水平相似,IL-10誘導(dǎo)的Jak-1、Tyk-2、Star-1、Stat-3磷酸化水平也沒(méi)有明顯差別,但是IL-10R誘導(dǎo)的基因表達(dá)有顯著差異,主要是凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞因子及其受體基因。
　　 為了研究IL-1

7、0R1外顯子基因多態(tài)性與中國(guó)漢族SLE患者發(fā)病的相關(guān)性,我們首先對(duì)50例中國(guó)北方漢族人群IL-10R1外顯子進(jìn)行了基因測(cè)序,得到了中國(guó)漢族人IL-10R1外顯子基因多態(tài)性的分布情況,進(jìn)而篩選出分布頻率大于0.1的能導(dǎo)致編碼氨基酸改變的有義SNP位點(diǎn)進(jìn)行了疾病相關(guān)性分析。為進(jìn)一步明確IL-10R在SLE發(fā)病過(guò)程中的作用,我們還應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)了SLE患者及正常對(duì)照者外周血細(xì)胞的IL-10R1表達(dá)情況和IL-10R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有無(wú)異常

8、。
　　 試驗(yàn)方法：
　　 一、病例
　　 在基因相關(guān)性分析中,對(duì)309例SLE患者和303例正常對(duì)照者進(jìn)行了IL-10R1外顯子基因多態(tài)性檢測(cè)。對(duì)28例SLE患者和14例正常對(duì)照進(jìn)行了外周血細(xì)胞IL-10R1表達(dá)檢測(cè),其中14例狼瘡腎炎患者,14例非狼瘡腎炎。共對(duì)13例SLE患者和7例正常對(duì)照者進(jìn)行了IL-10R通路的檢測(cè)。
　　 SLE的診斷符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)制定的SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),

9、分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)11項(xiàng)中,如有4項(xiàng)或4項(xiàng)以上診斷為SLE。正常對(duì)照者與SLE患者性別、年齡相匹配。以SLE疾病活動(dòng)性指數(shù)(SLE disease activity index,SLEDAI)判定SLE疾病活動(dòng)性,計(jì)分超過(guò)或等于9分為病情活動(dòng)(Active),否則為非活動(dòng)性(Inactive)。
　　 二、DNA測(cè)序
　　 采用酚氯仿法提取基因組DNA。根據(jù)IL-10R1的7個(gè)外顯子分別設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增序列包含各外顯子上下游至少50

10、個(gè)堿基對(duì)。PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳后切膠,回收純化,行測(cè)序PCR反應(yīng)及基因測(cè)序。
　　 三、IL-10R1表達(dá)
　　 于早晨空腹時(shí)抽取肘靜脈肝素抗凝血。標(biāo)記方法如下:100ul全血細(xì)胞,分別加入不同的熒光抗體或同種型對(duì)照,室溫下避光標(biāo)記30分鐘(min),然后紅細(xì)胞裂解15min,PBS洗細(xì)胞兩次,上機(jī)檢測(cè)。
　　 四、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)
　　 應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,PBS洗兩

11、次,最后加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,放入濕潤(rùn)37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 五、磷酸化染色
　　 調(diào)整PBMC濃度為5×105/ml,加入24孔板,在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí),之后加入不同劑量的重組人IL-10或PBS(陰性對(duì)照)處理細(xì)胞,然后按照流式細(xì)胞術(shù)磷酸化染色方法進(jìn)行Stat1、Stat3的磷酸化標(biāo)記、檢測(cè)。
　　 六、細(xì)胞增殖分析

12、r>　　 調(diào)整PBMC濃度為10×105/ml,加入96孔平底培養(yǎng)板中,培養(yǎng)1小時(shí)后加入IL-10或PBS處理細(xì)胞,再培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。增殖分析采用promage Celltiter96 AQ One solution試劑盒。以IL-10處理后細(xì)胞的吸光度與PBS處理后細(xì)胞的吸光度的比值表示細(xì)胞增值率。
　　 試驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、中國(guó)漢族人群IL-10R1外顯子多態(tài)性分布情況:
　　 首先,我們

13、對(duì)50個(gè)樣本IL-10R1全部7個(gè)外顯子進(jìn)行了測(cè)序,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP位點(diǎn),分別為位于外顯子2的G254A(rs4252249),位于外顯子4的A533G(rs2256111)和G599A(rs2228054),位于外顯子5的A744G(rs2228055),位于外顯子6的C810T,位于外顯子7的C1046T(rs2229115)和A1125G(rs2229113)。其中A744G、C810T、A1125G是能夠?qū)е戮幋a氨基酸序列改

14、變的有義SNP位點(diǎn)。選擇分布頻率大于0.1的有義SNP位點(diǎn)A744G做了進(jìn)一步的相關(guān)性分析。
　　 二、IL-10R1 SNP位點(diǎn)A744G與SLE發(fā)病的相關(guān)性分析:
　　 共完成了309例SLE患者和303例正常對(duì)照者IL-10R Exon5 DNA測(cè)序。結(jié)果顯示正常對(duì)照組中A744G位點(diǎn)g等位基因分布頻率為24.6％,a等位基因分布頻率為75.4％,SLE患者組中g(shù)等位基因分布頻率為25.6％,a等位基因分布頻率為7

15、4.4％。a、g等位基因在SLE患者組和正常對(duì)照組中的分布沒(méi)有差異,p=0.693。而A744A、A744G、G744G基因型在兩組中的分布頻率也沒(méi)有差異,p=0.906,這說(shuō)明此SNP位點(diǎn)與SLE的發(fā)病沒(méi)有相關(guān)性。
　　 三、IL-10R1在SLE外周血中的表達(dá)情況:
　　 IL-10R1在外周血CD14+單核細(xì)胞中表達(dá)百分率和平均熒光強(qiáng)度最高,其次為CD8+T細(xì)胞,再次為CD4+T細(xì)胞,CD19+細(xì)胞表達(dá)最低。

16、>　　 總的SLE患者組和正常對(duì)照組相比,各細(xì)胞群內(nèi)IL-10R1的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是狼瘡腎炎組(LN,14例)的IL-10R1表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(14例)和非狼瘡腎炎組(14例),其中CD4+細(xì)胞群內(nèi)MFI(12.8±2.9)與正常對(duì)照組(15.9±2.4)相比具有明顯差異,p值為0.005。另外,活動(dòng)性狼瘡患者組的CD4+細(xì)胞群內(nèi)IL-10R1表達(dá)水平低于穩(wěn)定期狼瘡患者組,MFI分別為14.0±4.0和17.6±4.

17、7,p值為0.038。
　　 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的IL-10Rl MFI與SLEDAI評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)(p值分別為0.007和0.004),即IL-10R1表達(dá)水平越高,其疾病活動(dòng)度越低,反之,IL-10R1表達(dá)水平越低,其疾病活動(dòng)度越高。而CD14+細(xì)胞的IL-10R1 MFI與SLEDAI評(píng)分無(wú)相關(guān)性。
　　 四、IL-10刺激后Stat1、Stat3的磷酸化分析:
　　 不加IL-10的PBMC

18、有一部分是處于磷酸化狀態(tài)的。加入IL-10刺激后,Stat1、Stat3磷酸化細(xì)胞比例及磷酸化水平均有增高,以磷酸化Stat3的增高水平顯著,10ng/ml刺激15min時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞比例可達(dá)90％以上,而Stat1-P的增高水平較低。說(shuō)明IL-10刺激后Stat3是主要的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 5ng/ml IL-10即對(duì)PBMC的Stat1、Stat3的磷酸化有刺激作用,10ng/ml IL-10刺激作用達(dá)到平臺(tái)期。IL-10刺激5m

19、in時(shí)可見(jiàn)Stat3明顯的磷酸化,正常人在15min時(shí)磷酸化水平達(dá)到高峰,30min時(shí)開(kāi)始下降,而SLE患者Stat3磷酸化延遲,30min時(shí)才達(dá)高峰。
　　 IL-10刺激后Stat3磷酸化水平在總SLE組與正常對(duì)照組之間沒(méi)有差別。而活動(dòng)性SLE組IL-10刺激后Stat3磷酸化水平,明顯低于正常對(duì)照組和非活動(dòng)性SLE組,p＜0.001,提示活動(dòng)性SLE的IL-10R-Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有異常改變。Stat1磷酸化水平在各

20、組中均沒(méi)有差別。
　　 五、IL-10對(duì)PBMC的抑制作用研究:
　　 用5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml IL-10分別刺激分離培養(yǎng)的PBMC,72小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞增殖率。與正常人相比,IL-10對(duì)SLE患者PBMC的抑制作用減弱,但是差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、共發(fā)現(xiàn)IL-10R1外顯子7個(gè)SNP位點(diǎn),分布頻率與歐洲白種人不同。分布頻率＞0.1的有義SNP位點(diǎn)