重組腺病毒三突變型低氧誘導(dǎo)因子-1α治療兔后肢缺血的安全性初步研究.pdf

1、背景
　　 缺血性疾病通常由動(dòng)脈狹窄或閉塞引起,包括外周梗死性血管病、冠狀動(dòng)脈梗死等。臨床上主要采用內(nèi)科藥物、血管成形術(shù)或外科搭橋術(shù)治療,但仍然存在諸多問題,例如介入后的再狹窄、旁路移植術(shù)后的血管再閉塞,以及嚴(yán)重廣泛的彌漫性病變難于用上述傳統(tǒng)的三種方法治療等。因此必須尋求其它更有效的治療方法。“治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)”治療缺血性疾病是近年來國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。治療性血管新生,就是通過

2、應(yīng)用血管生長因子或其基因,促進(jìn)缺血組織的血管新生和側(cè)支血管形成,使缺血得到改善的新的治療方法。近十余年來,研究者們一直在尋找一種有效的刺激新生血管形成的基因。研究最多的是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)。但研究資料卻顯示VEGF可導(dǎo)致新生血管不成熟、組織水腫、血管滲漏、炎癥反應(yīng)重,甚至可能促進(jìn)

3、動(dòng)脈硬化進(jìn)展及血管瘤形成等；FGF治療則與蛋白尿等有關(guān)。因此,人們期望尋找一種能誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生且安全的基因。
　　 人低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hyooxia inducible factor 1α,HIF-1α)作為低氧或缺氧應(yīng)答反應(yīng)中“總開關(guān)”基因而日益受到重視。它可調(diào)控下游60多種與血管生長、血管張力、糖代謝、紅細(xì)胞生成及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化等相關(guān)的基因,包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體(Flt-1),血管生成素(

4、Ang)1,2,4,血小板衍生生長因子(PDGF)等。HIF-1α通過促進(jìn)VEGF、Ang-2、Ang-4、PDGF等基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)血管新生,這些因子相互協(xié)同、相互影響,有望生成生理功能完整的血管。但是,在常氧狀態(tài)下,HIF-1α容易降解,主要與常氧狀態(tài)下HIF-1α氧依賴降解結(jié)構(gòu)區(qū)域(oxygen-dependent degradation domain,ODDD)Pro564和Pro402發(fā)生羥基化導(dǎo)致其水解有關(guān),經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究,突變其中

5、任一位點(diǎn)的單突變型HIF-1α在常氧下都可以得到表達(dá),不過雙突變型HIF-1α則是近乎一種組成型表達(dá)；而Asn804突變則可以促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 目前,國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)將野生型或突變型HIF-1α基因通過腺病毒、質(zhì)?；蛘甙捳畈《镜容d體轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)鼠、兔等動(dòng)物缺血肢體或心臟血管新生,但涉及HIF-1α在活體表達(dá)的安全性評價(jià)則鮮見報(bào)道,而重組腺病毒三突變型低氧誘導(dǎo)因子-1α在體實(shí)驗(yàn)更是未見相關(guān)報(bào)道。
　　 因此,本課題組

6、前期已將HIF-1α的564、402、803三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合定點(diǎn)突變,成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的三突變型HIF-1α-Trip(Ad-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),使其在常氧下能夠穩(wěn)定高效表達(dá)；體外研究顯示Ad-HIF-1α-Trip對hMVECs增殖效應(yīng)較Ad-HIF-1α-nature強(qiáng),且HIF-1α蛋白表達(dá)水平高。本課題組在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步明確Ad-HIF-1α-Trip應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)是否安全,

7、將Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染于兔急性后肢缺血模型中,觀察其在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)可能出現(xiàn)的毒副作用,對其安全性進(jìn)行初步評價(jià),為進(jìn)一步進(jìn)行與人類相似的靈長目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)提供依據(jù)。
　　 目的
　　 基因藥物治療時(shí)安全性和有效性同等重要,為了深入研究.Ad-HIF-1α-Trip基因在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)是否安全,本課題將Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染于兔急性后肢缺血模型中,觀察其在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)時(shí)可能出現(xiàn)的毒副作用,對其安全性

8、進(jìn)行初步評價(jià)。
　　 方法
　　 第一部分:將本課題組先前構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-HIF-1α-Trip、空腺病毒載體Ad-Blank,在HEK293A細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增,經(jīng)氯化銫密度梯度離心法純化,終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度；提取純化后病毒DNA,采用PCR法及基因測序?qū)θ蛔冃虷IF-1α基因信息進(jìn)行鑒定。
　　 第二部分:1、構(gòu)建急性兔后肢缺血模型,造模成功后即將模型兔隨機(jī)分3組,每組6只,分別為Ad-HIF-1

9、α-Trip組、Ad-Blank組和生理鹽水(NS)組。分別以Ad-HIF-1α-Trip(2.0×1010 pfu)、Ad-Blank(2.0×1010pfu)、和生理鹽水(NS0.5ml)肌注術(shù)側(cè)后肢骨骼肌。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)周期為28天。每天觀測各組實(shí)驗(yàn)兔一般藥物反應(yīng)；術(shù)前及術(shù)后7d、28d行血常規(guī)和肝腎功能檢測及心電圖檢查；動(dòng)物觀察28d后全部處死,均做大體解剖,檢查肌肉、心、肝、肺、腎、睪丸等組織臟器是否有大體病變,上

10、述所有臟器均取材制作常規(guī)組織病理切片,鏡檢。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:在HEK293A細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增后獲得重組腺病毒.Ad-HIF-1α-Trip、空腺病毒載體Ad-Blank,純化后終點(diǎn)稀釋法測得的滴度分別為2.5×1012 pfu/ml,4.0×1012 pfu/ml。重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后24h即可出現(xiàn)病變效應(yīng)(CPE)。提取Ad-HIF-1α-Trip DNA,PCR檢測HIF-1α基因得到預(yù)期的38

11、0bp、460bp、214bp的目的片段,且DNA測序結(jié)果正確,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。
　　 第二部分:在觀察期間各組動(dòng)物精神、食欲良好,大便成形,尿液無渾濁,體溫約在38℃。術(shù)后28d三組兔體重均有所增加,無一動(dòng)物死亡；心電圖檢查顯示三組兔均無心律失常發(fā)生,P波、QRS波、T波、ST段無異常；血常規(guī)、肝腎功能檢測,重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果顯示,血常規(guī)WBC計(jì)數(shù)在day0、day7和day28之間有顯著差異(P=11.257,P=0

12、.000),三個(gè)處理組間無顯著性差異(F=0.500,P=0.617),且兩者不存在交互作用(F=0.333,P=0.969),WBC計(jì)數(shù)在day7最高,但在正常值范圍內(nèi),day28則下降至接近day0水平；One-Way ANOVA結(jié)果顯示,day0、day7、day28各組間WBC計(jì)數(shù)無顯著差異(F=0.138,P=0.872；F=0.273,P=0.765；F=0.648,P=0.537)。肝功能AST、ALT值在day0、day

13、7和day28之間有顯著差異(F=8.525,P=0.001；F=25.547,P=0.000),三個(gè)處理組間無顯著性差異(F=2.752,P=0.096；F=0.056,P=0.946),且ALT、AST值均不存在組別與時(shí)間點(diǎn)的交互作用(F=1.238,P=0.316；F=2.311,P=0.081),AST、ALT值均在day7最高,但在正常值范圍內(nèi),day28則下降至接近day0水平；One-Way/UNOVA結(jié)果顯示,day0、

14、day7、day28各組間AST值均無顯著差異(F=1.484,P=0.258；F=1.733,P=0.210:F=1.898,P=0.184)；day0、day7、day28各組間ALT值亦均無顯著差異(F=0.612,P=0.555；F=2.620,P=0.127；F=2.297,P=0.135)。其余指標(biāo)未見明顯異常,各時(shí)間點(diǎn)間對比、各組間對比均無顯著差異(P>0.05),同一時(shí)間點(diǎn)各組間對比亦無顯著差異(P>0.05)。病理組織

15、學(xué)檢查,三組兔心、肝、肺、腎、睪丸、Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染部位肌肉色澤、體積正常；組織切片光鏡下觀察,結(jié)構(gòu)正常,無明顯水腫,無明顯炎性細(xì)胞侵潤,未見癌細(xì)胞。
　　 結(jié)論
　　 第一部分:本課題組先前構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-HIF-1αTrip、空腺病毒載體Ad-Blank擴(kuò)增后獲得較高的滴度,PCR法及基因測序鑒定符合預(yù)期目標(biāo),為下一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了保證。
　　 第二部分:兔急性缺血模型局部一次性肌肉注射劑