凍干重組腺病毒三突變型低氧誘導(dǎo)因子-1a的制備及其生物學(xué)效應(yīng)考察.pdf

1、研究背景：
　　 目前我國(guó)正逐漸步入老齡化社會(huì),由于高血壓、糖尿病、高脂血癥等相關(guān)疾病發(fā)病率的上升,加之現(xiàn)代人們不合理的飲食結(jié)構(gòu)、不良的生活方式以及較大的精神壓力,缺血性心血管疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟、外周缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升,病死率、致殘率高,不僅嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量,而且給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如今,常規(guī)藥物治療、外科和經(jīng)皮介入血管重建術(shù)的快速發(fā)展使得大部分患者能夠正常的生活工作。然而,仍有一部分患者術(shù)后

2、出現(xiàn)再狹窄、微血管功能障礙,或由于彌漫性或嚴(yán)重的病變不適于常規(guī)血管成形術(shù),而藥物治療不能有效控制癥狀。因此,必須再尋求其他新的治療策略。
　　 上世紀(jì)90年代以來(lái),人們發(fā)現(xiàn),組織器官缺血時(shí),機(jī)體內(nèi)促血管生成相關(guān)因子的表達(dá)反應(yīng)性增加,通過(guò)促進(jìn)缺血組織的血管新生,加速側(cè)枝循環(huán)的建立,從而改善血流灌注,但自身代償往往不充分、不及時(shí),而給予外源性生長(zhǎng)因子,即“治療性血管新生”為缺血性疾病治療提供了新的思路,是當(dāng)前國(guó)際上最熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一

3、。
　　 最早用于治療性血管新生的有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)。VEGF和FGF通過(guò)了Ⅰ期臨床試驗(yàn),但Ⅱ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果卻不盡如人意。VEGF不能誘導(dǎo)功能成熟的血管形成,出現(xiàn)血管滲漏、組織水腫等不良反應(yīng)；FGF治療可以促進(jìn)血管新生,但部分患者出現(xiàn)蛋白尿。目前,有關(guān)VEGF和FGF的

4、臨床研究已經(jīng)停止。
　　 人們逐漸意識(shí)到血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,單純針對(duì)某階段或應(yīng)用單一因子干預(yù)治療難以形成趨近生理狀態(tài)的成熟的新生血管。如何實(shí)現(xiàn)理想血管重建是血管新生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn),近年來(lái)研究顯示:低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是一個(gè)非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子,由α和β兩個(gè)亞基組成,α為其功能活性亞基。HIF—1α與β結(jié)合后,從胞漿轉(zhuǎn)位到核內(nèi),直接或間接調(diào)控多種下游靶基因

5、,涉及到血管生長(zhǎng)、血管張力、糖代謝、紅細(xì)胞生成等多種病理生理改變。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)參與血管新生的30多種基因受HIF-1α的調(diào)控,因此,HIF-1α是血管新生的上游核心調(diào)控因子。臨床前期研究表明,HIF-1α治療誘導(dǎo)的新生血管具有無(wú)明顯炎癥反應(yīng)、不滲漏、不引起組織水腫的特點(diǎn)從而形成生理功能完整的新生血管。因此,HIF-1α是一個(gè)十分具有應(yīng)用前景的血管新生治療因子。
　　 然而,HIF-1α在常氧下的半衰期很短,5min即可全部

6、降解。這是由于HIF-1α含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain,ODDD),ODDD區(qū)Pro402以及Pr0564兩個(gè)脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性。常氧情況下,Pro402和/或Pro564被脯氨酸羥化酶(pprolyl hydroxylase domain,PHD)羥化后,經(jīng)泛素途徑降解。低氧時(shí),該過(guò)程受到抑制,HIF-1α不被降解因而變得穩(wěn)定。
　　 氧濃度除了對(duì)H

7、IF-1α蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)以外,更為重要的是對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。HIF-1α的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(C-Transactivation Domains,C-TKD),常氧情況下,C-TAD803位點(diǎn)的天門冬酰胺(Asn803)被羥化,可阻止HIF-1α與部分輔助激活因子(如CBP/p300)的結(jié)合,降低其轉(zhuǎn)錄活性。故即使蛋白穩(wěn)定的HIF轉(zhuǎn)位到核內(nèi)后,因HIF-1α的C-TAD Asn803羥化,降低了激活下游靶基因的能力。低氧時(shí),

8、該過(guò)程受到抑制,不能有效的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)Asn803羥基反應(yīng),從而導(dǎo)致HIF-1α的高轉(zhuǎn)錄活性。
　　 在此基礎(chǔ)上,本課題組將HIF-1α的ODDD區(qū)Pro402和Pro564以及C-TAD區(qū)Asn803進(jìn)行了點(diǎn)突變,并選擇具有可轉(zhuǎn)染非增殖細(xì)胞并且轉(zhuǎn)染效率高、無(wú)致瘤性、容易獲得高滴度等優(yōu)點(diǎn)的腺病毒作為基因載體,成功構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的三突變型HIF-1α(Ad-HIF-1α-Trip),使其在常氧不僅能穩(wěn)定表達(dá),而且具有高轉(zhuǎn)錄活性,可

9、以促進(jìn)下游血管生成因子的表達(dá),有利于誘導(dǎo)成熟的血管新生。
　　 盡管我們已驗(yàn)證了Ad-HIF-1α-Trip高生物學(xué)活性并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了成功,可望應(yīng)用于臨床,但是腺病毒在溶液中理化性質(zhì)不穩(wěn)定、不耐熱,通常需保存在含有冷凍保護(hù)劑的緩沖液中,并于-80℃儲(chǔ)存。由于運(yùn)輸必須在干冰上進(jìn)行、儲(chǔ)存冷鏈限制、使用前需要凍融等因素,限制了其未來(lái)的臨床應(yīng)用。冷凍干燥是將含水物料低溫冷凍使之凍結(jié),然后在低溫、高真空條件下使冰轉(zhuǎn)變?yōu)樗魵?除去自

10、由水,再進(jìn)行第二次干燥,除去部分吸附于固體間隙中的結(jié)合水的干燥方法。其優(yōu)點(diǎn)和意義在于:冰的升華帶走熱量使凍干整個(gè)過(guò)程保持低溫凍結(jié)狀態(tài),因此非常適用于熱敏具有生物活性藥品的干燥；真空狀態(tài)可以對(duì)藥品起到抗氧化的作用；而干燥后的物質(zhì)含水量非常少、重量輕,有利于在0-4℃甚至室溫條件下保存和運(yùn)輸；使用方便,加蒸餾水或生理鹽水制成溶液,即可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。在凍干過(guò)程以及儲(chǔ)存過(guò)程均存在影響藥品穩(wěn)定性的因素,需要添加凍干保護(hù)劑,而不同的物料由于其

11、結(jié)構(gòu)和組分的差異,凍干保護(hù)劑也不盡相同,選擇合適的凍干保護(hù)劑是制備出高質(zhì)量?jī)龈僧a(chǎn)品的關(guān)鍵。此外,Ad-HIF-1α-Trip用于基因治療,需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察凍干后Ad-HIF-1α-Trip的生物學(xué)活性。
　　 目的：
　　 篩選合適的凍干保護(hù)劑制備凍干Ad-HIF-1α-Trip,觀察其在0-4℃條件下保存長(zhǎng)期穩(wěn)定性并且考察凍干后Ad-HIF-1α-Trip的生物學(xué)活性,為Ad-HIF-1α-Trip將來(lái)臨床應(yīng)用提供劑型

12、方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將重組腺病毒載體Ad-HIF-1α-Trip、Ad-Null以及Ad-LacZ在低代HEK293A細(xì)胞中進(jìn)行病毒擴(kuò)增；氯化銫濃度梯度離心透析純化；純化后提取病毒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),同時(shí)行基因測(cè)序進(jìn)行鑒定；終點(diǎn)稀釋法測(cè)定病毒滴度。
　　 2.初選3組處方,其組成(w/v):A.10％海藻糖、0.5％明膠、3％山梨醇:B.10％蔗糖、0.5％明膠、3％山梨醇；C.5％海藻糖

13、、5％蔗糖、0.5％明膠、3％山梨醇；按照上述保護(hù)劑分組的百分比要求,加入到磷酸鹽緩沖液中,分別與稀釋的Ad-HIF-1α-Trip原液按1:1比例混合,0.5ml/西林瓶分裝,以適當(dāng)凍干曲線進(jìn)行凍干。根據(jù)凍干后物理性狀、病毒滴度測(cè)定篩選凍干保護(hù)劑。進(jìn)行加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn),并在凍干后1天以及第3、6、12個(gè)月測(cè)定病毒滴度觀察凍干Ad-HIF-1α-Trip熱穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
　　 3.Ad-LacZ以不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)轉(zhuǎn)染

14、微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hMVECs),經(jīng)X-Gal染色法測(cè)定重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率。96孔板培養(yǎng)hMVECs,凍干前Ad-HIF-1α-Trip、凍干后Ad-HIF-1α-Trip分別以最佳MOI轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后第24,48,72,96,120小時(shí)用MTS方法檢測(cè)測(cè)細(xì)胞增殖的情況。
　　 4.分別在Ad-HIF-1α-Trip凍干后1天、凍干后6月、凍干后12月時(shí)間點(diǎn)提取病毒DNA,進(jìn)行PCR及PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定三突變型HIF-1α基因

15、；并在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)以Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染hMVECs,提取72小時(shí)蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)及下游VEGF蛋白的表達(dá),與液體Ad-HIF-1α-Trip加以比較。
　　 5.應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以(x)±s表示。凍干后不同保護(hù)劑組間Ad-HIF-1α-Trip滴度比較采用單向方差分析,方差齊時(shí)組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Games-Howel

16、l檢驗(yàn)；各組凍干前后滴度比較采用單樣本t檢驗(yàn)。凍干后腺病毒加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)所測(cè)得滴度、MTS測(cè)得吸光度值組間比較及組內(nèi)不同時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,多重比較采用LSD法；加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)同一時(shí)間點(diǎn)組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)、MTS測(cè)得吸光度值組間比較采用單向方差分析。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.在HEK293A細(xì)胞內(nèi)反復(fù)擴(kuò)增后獲得重組腺病毒Ad-HIF-

17、1α-Trip、Ad-Null和Ad-LacZ經(jīng)氯化銫純化后,終點(diǎn)稀釋法測(cè)得的滴度分別為12.6LgPFU/ml、11.2LgPFU/ml、10.3LgPFU/ml。提取Ad-HIF-1α-Trip病毒DNA,PCR檢測(cè)HIF-1α基因得到預(yù)期的380bp、460bp、214bp的目的片段,且DNA測(cè)序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2.以10％海藻糖、0.5％明膠、3％山梨醇保護(hù)劑制備的凍干腺病毒外觀呈白色餅塊狀,殘余水分含量<3％

18、,凍干后Ad-HIF-1α-Trip感染性滴度下降0.33LgPFU/ml,相比其他保護(hù)劑組具有較好的保護(hù)效果(P<0.01)；凍干Ad-HIF-1α-Trip與液體Ad-HIF-1α-Tdp在37℃條件下放置滴度均呈下降趨勢(shì),但凍干Ad-HIF-1α—Trip下降幅度小,放置3周后,滴度僅下降0.8LgPFU/ml,熱穩(wěn)定性好于液體腺病毒組(P<0.01):凍干Ad—HIF-1α-Trip在0-4℃保存12月,滴度僅下降0.67LgP

19、FU/ml。其穩(wěn)定性好于0-4℃保存液體Ad—HIF-1α-Trip組和添加甘油保護(hù)劑-20℃保存的Ad-HIF-1α-Trip組(P<0.01),
　　 3.Ad-LacZ以不同MOI轉(zhuǎn)染hMVECs,X-gal染色結(jié)果顯示當(dāng)MOI為100pfu/cell時(shí),重組腺病毒的感染效率趨于穩(wěn)定,均在75％以上。MTS檢測(cè)顯示,液體Ad-HIF-1α-Trip和凍干Ad—HIF-1α-Trip對(duì)hMVECs增殖無(wú)顯著差異(P>0.05

20、),但均與空白對(duì)照組之間有顯著差異(P<0.01)。
　　 4.經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定,凍干后1天、6月、12月的腺病毒所攜帶的目的基因信息無(wú)丟失或變異；western blot結(jié)果顯示:凍干后1天、6月、12月的Ad-HIF-1α-Trip與液體Ad-HIF-1α-Trip轉(zhuǎn)染hMVECs后HIF-1α蛋白以及VEGF蛋白表達(dá)量與相當(dāng),且均高于Ad-Null組表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.本課題組構(gòu)建的重

21、組腺病毒載體Ad-HIF-1α-Trip、Ad-Null和Ad-LacZ擴(kuò)增后能獲得較高的滴度,且轉(zhuǎn)染效率高,為下一步實(shí)驗(yàn)提供了保證。
　　 2.以合適的保護(hù)劑制備凍干Ad-HIF-1α-Trip能達(dá)到較滿意的凍干效果。凍干后Ad-HIF-1α-Trip在0-4℃條件下能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。
　　 3.凍干后Ad—HEF-1α-Trip仍具有良好的促進(jìn)hMVECs增殖。
　　 4.凍干能夠長(zhǎng)期保持Ad-HIF-1α-