前列腺癌相關融合基因TMPRSS2-ERG及循環(huán)microRNA的研究.pdf

1、本文圍繞前列腺癌的基礎和臨床展開，嘗試闡明TMPRSS2—ERG融合基因在前列腺癌發(fā)病中的作用機制；同時，針對當前前列腺癌早期診斷中存在的問題，試圖發(fā)現(xiàn)可用于前列腺癌診斷的新的生物標志物。
　　 1．染色體結構的改變常見于惡性腫瘤細胞中，其中染色體易位導致原癌基因的融合可能是某些腫瘤發(fā)生的重要原因。2005年，Tomlins等在Science報道在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)了受雄激素調(diào)控的基因TMPRSS2和原癌基因ETS家族成員發(fā)生了融合

2、，隨后的幾個獨立研究結果顯示該類融合基因在高加索前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)比率約為50％—70％，其中最常見的融合類型為TMPRSS2—ERG，約占50％。近年來對TMPRSS2—ERG融合基因功能的研究已初步表明該融合基因?qū)毎脑鲋场⒎只?、侵襲等性狀均具有一定的影響。由于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展一方面體現(xiàn)在不受控的細胞增殖，另外同樣重要的一個因素則是腫瘤細胞的凋亡異常。因此，TMPRSS2—ERG基因是否影響細胞的凋亡是一個值得深入研究的問題

3、。此外，由于前列腺癌在不同遺傳背景的人種群體間發(fā)病率和致死率差異均較大，而對這一融合基因的研究以往都以歐美人群為主，亞洲人群，尤其是中國人群這一融合基因的發(fā)生率如何還不清楚。因此，本論文第一部分的研究內(nèi)容分為兩個方面，首先篩查融合基因在中國前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)頻率，其次對TMPRSS2—ERG融合基因是否影響細胞凋亡進行探討。
　　 我們推測：融合基因TMPRSS2—ERG在中國前列腺癌病人群體中發(fā)生的頻率可能不同于基于高加

4、索病人群體的檢測結果。由于融合基因TMPRSS2—ERG的編碼蛋白和同一家族Fli—1基因編碼蛋白具有相同的結構域，因此可能和Fli—1類似，參與細胞凋亡的調(diào)控。
　　 2．由于目前對晚期前列腺癌的治療很難達到理想的效果，所以當前更重要的一個問題是該疾病的早期診斷。盡管前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)的檢測是一種常規(guī)的檢測手段，但其靈敏性和特異性都欠佳，急需發(fā)現(xiàn)一種更好的檢測指標。近

5、幾年來，已有許多研究證明在血清或血漿中有穩(wěn)定的循環(huán)microRNAs(miRNAs)存在，進一步的研究表明miRNAs具有作為癌癥標志物的潛能，并且外周血miRNAs的表達譜可以區(qū)分各類腫瘤，具有組織特異性。新的證據(jù)顯示糖尿病患者血清miRNA表達譜與健康對照比較也有顯著的差異；同時，miRNAs也可用來區(qū)分診斷急性肝臟損傷等疾病，并可用作心肌損傷的標志物[1—3]。這些研究都表明外周血循環(huán)miRNA具備良好疾病標志物的潛能，因此本論文

6、的第二部分中我們檢測并嘗試篩選出前列腺癌特異性的循環(huán)miRNAs，以驗證這些miRNAs潛在的診斷效能。
　　 第一部分前列腺癌融合基因TMPRSS2—ERG的研究
　　 目的：初步評估TMPRSS2—ETS融合基因在中國前列腺癌病人群體中的出現(xiàn)頻率，獲得TMPRSS2—ERG融合基因參與細胞凋亡調(diào)控的證據(jù)。
　　 方法：
　　 1．前列腺癌穿刺標本抽提總RNA，nest—PCR檢測融合序列，經(jīng)T/A克隆

7、入載體，測序驗證。
　　 2．構建融合基因編碼序列△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，劃痕實驗檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的遷移率；CCK—8測定生長曲線及細胞毒性；Western Blot檢測凋亡相關蛋白；Annexin—V PE和7—AAD雙染色后，流式細胞儀檢測凋亡；siERG轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株介導△ERG基因的表達下調(diào)；熒光實時定量PCR檢測凋亡相關基因的表達。
　　 結果：
　　 1．在我們獲得的27列前列腺癌樣本中檢出6例TMPRSS

8、2—ERG基因融合，占22％，未檢測到TMPRSS2—ETV1基因融合。5份良性增生(BPH)樣本中未檢測到融合基因。但在一例前列腺癌樣本中發(fā)現(xiàn)一種新的融合基因TMPRSS2—EGR1，其功能有待進一步的研究。
　　 2．成功構建高表達ΔERG的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，細胞生長曲線和遷移率和空載體對照細胞株無明顯差異。順鉑(cisplatin)處理48h后，△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)株存活率為對照細胞株的3倍，流式細胞儀檢測到的細胞凋亡率各為25．89±

9、9．66％和67．26±9．07％。在△ERG基因干擾后的試驗中其凋亡比率由原來的41．50±6．70％升至59．64±3．23％。
　　 3．Western Blot結果顯示△ERG穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞處理后caspase—3和Parp—1的斷裂片段的蛋白量顯著低于對照細胞。定量PCR表明與凋亡直接相關的基因BCL—2，BCL—XL，BAX，BIM與對照組空載體細胞株相比都沒有明顯的表達變化；間接與凋亡通路相關的基因ATF—5(acti

10、vating transcription factor5)則上升了2．5倍左右。兩種細胞DNA損傷指標γH2AX的蛋白表達量則相差1．5倍左右。
　　 結論：
　　 1．我們的初步篩選結果表明TMPRSS2—ERG融合基因在中國前列腺癌病人群體中出現(xiàn)頻率較低，有必要擴大樣本量進一步驗證。
　　 2．在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)一例新的融合基因TMPRSS2—EGR1。
　　 3．TMPRSS2—ERG融合基因T3/E

11、5可編碼N端缺失的ERG蛋白(△ERG)，△ERG可抑制順鉑誘導的DNA損傷，并進而抑制順鉑誘導的細胞凋亡。
　　 第二部分循環(huán)MicroRNA作為前列腺癌診斷指標的研究
　　 目的：通過對循環(huán)miRNAs的篩查發(fā)現(xiàn)前列腺癌特異性的miRNAs，并驗證其診斷效能。
　　 方法：
　　 1．本實驗包括篩選鑒定和獨立驗證兩個步驟，篩選組由17份正常對照和25份前列腺癌(CaP)病人的血樣組成，另一組為獨立驗證

12、組，包括44份正常對照樣本和80份前列腺癌樣本。
　　 2．采用Illumina’s miRNA表達分析平臺，篩選前列腺癌患者和正常對照組之間的循環(huán)miRNAs的表達譜差異，并用實時熒光定量PCR于獨立的大樣本中進一步鑒定和驗證差異表達miRNAs，根據(jù)ROC曲線分析其診斷效能，并用主成分分析法評估鑒定的6個miRNAs的聯(lián)合診斷價值。
　　 結果：
　　 1．篩選階段在兩種樣本中發(fā)現(xiàn)有8個miRNAs(let—

13、7c，let—7e，miR—25，miR30c，miR—346，miR—622，mir—940，and miR—1285)表達水平具有顯著差異，最后驗證階段驗證獲得6個miRNAs(let—7c，let—7e，miR30c，miR—622，mir—940，andmiR—1285)。
　　 2．ROC(Receiver operating characteristic)曲線分析顯示6個miRNAs都具有一定的診斷價值，曲線下面積(