AD-PEDF對胃癌SGC7901細胞及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外作用的研究.pdf

1、目的:本研究采用腺病毒載體介導(dǎo)的重組色素上皮源性因子(recombinant pigment epithelium-derived factor adenovirus, Ad-PEDF)在體外感染胃癌SGC7901細胞，并檢測PEDF在該細胞中的的表達、分泌情況以及對SGC7901細胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管的影響，探討PEDF抗血管生成及對胃癌細胞生長、轉(zhuǎn)移的作用，探索胃癌基因治療的新方法。
　　方法:(1)將已構(gòu)建

2、好的攜帶PEDF基因的腺病毒(Ad-PEDF)及帶有綠色熒光蛋白基因的空載腺病毒(Ad-GFP)感染HEK293細胞，進行病毒擴增，收集病毒上清液。(2)擴增后的病毒上清液分別通過RT-PCR反應(yīng)和Western Blotting，鑒定病毒中PEDF基因的mRNA和蛋白的表達情況，用TCID50法測定擴增后的病毒滴度。(3)運用擴增后的Ad-PEDF及Ad-GFP病毒上清液以最佳感染復(fù)數(shù)感染體外培養(yǎng)的胃癌細胞系SGC7901，同時以未加

3、腺病毒的胃癌細胞系SGC7901組為空白對照組，72h后收集各組細胞條件培養(yǎng)基，運用Western Blotting鑒定各組細胞PEDF蛋白分泌表達情況。(4)體外培養(yǎng)胃癌細胞系SGC7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，運用CCK-8試劑盒檢測胃癌細胞系7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，在不同條件下的增殖抑制率。(5)體外培養(yǎng)胃癌細胞系SGC7901及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，運用Transwell小室研究其在不同條件下的侵襲及遷移的體外生物學(xué)活性。(

4、6)體外培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，觀察在各組不同條件下血管生成形態(tài)，研究色素上皮衍生因子對體外血管內(nèi)皮細胞生物活性。本實驗采用完全隨機單因素方差分析法（ANOVA法）對各組的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，并采用q檢驗進行組間兩兩比較，檢驗其差異性。
　　結(jié)果:(1)重組腺病毒載體感染HEK293細胞后在HEK293細胞中大量擴增。(2)按設(shè)計的PEDF引物序列PCR擴增Ad-PEDF可觀察到長約1.25kb的PEDF基因片段。免疫印跡(W

5、estern Blotting)結(jié)果顯示感染HEK293細胞的Ad-PEDF組得到分子量約為50 kDa的免疫雜交條帶，而Ad-GFP及未感染腺病毒的HEK293組未見目的雜交條帶出現(xiàn)，經(jīng)TCID50法鑒定擴增后的Ad-PEDF及Ad-GDF的病毒滴度較高，分別為6.3×107pfu/mL，Ad-GFP滴度約為6.3×108pfu/mL。(3)重組腺病毒感染胃癌細胞系SGC7901 Western Blotting分析結(jié)果顯示，Ad-P

6、EDF/胃癌7901可見PEDF目的蛋白的表達，而未轉(zhuǎn)染胃癌7901，Ad-GFP/胃癌7901則未見表達。(4)運用CCK8試劑盒分析重組PEDF對胃癌細胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增殖作用，結(jié)果顯示，與陰性組和對照組相比，Ad-PEDF組對胃癌細胞系SGC7901的增殖影響無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖實驗中，Ad-PEDF/胃癌SGC7901組OD值為0.35±0.01，與未感染胃癌SGC7901及A

7、d-GFP/胃癌SGC7901組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。(5)胃癌細胞及臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的侵襲、遷移實驗結(jié)果顯示，Ad-PEDF能明顯抑制胃癌細胞系SGC7901的侵襲、遷移，Ad-PEDF/胃癌細胞系SGC7901組阻止人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞侵襲及遷移，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。(6)基質(zhì)膠上模擬體外血管形成實驗結(jié)果可觀察到，未轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901及Ad-GFP/胃癌SGC7901組形成大量的小管，Ad-P