DNA芯片快速檢測多種性病病原體技術(shù)的研究與應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　利用多重PCR及反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，建立一種快速檢測性傳播疾病多種病原體的DNA芯片方法;應(yīng)用該方法檢測臨床樣本，評估其應(yīng)用價值;分析廣州市性病門診患者各種病原體的流行情況。
　　方法:
　　1.從GenBank獲取各菌株核苷酸序列并用生物信息學(xué)分析軟件DNAStar7.1分析其保守性和變異性，選擇目的基因，設(shè)計引物和探針。
　　2.多重PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增目的基因。
　　3.運(yùn)用導(dǎo)流雜交技術(shù)制備D

2、NA芯片。
　　4.DNA芯片技術(shù)檢測的敏感性和特異性分析。
　　5.收集性病標(biāo)本103份，用DNA芯片檢測常見病原體。
　　結(jié)果:
　　1.通過GenBank獲取淋病奈瑟菌(Ng)、沙眼衣原體(Ct)、生殖支原體(Mg)、梅毒螺旋體(Tp)16S rRNA基因，單純皰疹病毒(HSV)1型、2型糖蛋白gD基因，人乳頭瘤病毒(HPV)6、11、16、18型L1衣殼蛋白基因，運(yùn)用DNAStar7.1和PrimerPr

3、emier6.0比較分析其保守區(qū)和高變區(qū)，設(shè)計出分別針對16S rRNA基因、gD糖蛋白基因、L1蛋白基因的3對通用引物和各病原體特異性探針，引物Tm在(55±1)℃，探針Tm在(60±1)℃。Ng、 Ct、Mg、Tp、HSV-1、HSV-2、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18型擴(kuò)增片段長度分別為456 bp、456 bp、457 bp、457 bp、279 bp、279 bp、127 bp、127 bp、131 bp和133

4、 bp。
　　2.采用多重PCR同時擴(kuò)增16S rRNA基因、gD基因和L1基因，1％瓊脂糖凝膠電泳能得到相應(yīng)的目的條帶。優(yōu)化結(jié)果顯示Mg2+濃度1.5mM，引物濃度0.6μM，退火溫度52℃時為最適條件。
　　3.建立的導(dǎo)流雜交技術(shù)能同時檢測多種病原體，優(yōu)化結(jié)果顯示雜交溫度在42℃，探針濃度為20μM時能獲得理想結(jié)果。
　　4.敏感性分析結(jié)果顯示Ng、Ct、Mg、Tp、HSV-1、HSV-2、HPV6、HPV11、

5、HPV16、HPV18檢測敏感性分別為1 cfu、3 cfu、6.7 pg/μL、221 pg/μL、1 cfu、1 cfu、250 pg/μL、223 pg/μL、175 pg/μL、182 pg/μL。特異性分析顯示各探針僅與相應(yīng)病原體雜交，不與其他檢測病原體或泌尿生殖道其他常見病原體交叉反應(yīng)。
　　5.DNA芯片雜交檢測103份臨床樣本，與臨床常規(guī)檢測結(jié)果比較，符合率為97.1％(100/103)。共檢出Ng2例，Ct14例

6、，Mg5例，HSV-218例，HPV68例，HPV1110例，HPV163例。未檢出Tp、HSV-1和HPV18。
　　6.尿道或?qū)m頸中Ct感染率高達(dá)21％，遠(yuǎn)高于Ng和Mg感染率，兩者分別為3.2％和4.8％。生殖器潰瘍中檢出病原體均為HSV-2。前列腺樣本中檢出1例Ct和2例Mg。在生殖器疣樣本中HPV6和HPV11檢出率顯著高于HPV16和HPV18。
　　結(jié)論:
　　1.DNA芯片技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地同時檢測Ng