基于重組腺病毒載體的烈性病原體疫苗研究.pdf

1、埃博拉病毒和炭疽芽孢桿菌均為A類生物戰(zhàn)劑,可用于生物恐怖襲擊。對(duì)此,非常有必要開(kāi)發(fā)一種能快速引起免疫反應(yīng)的疫苗以應(yīng)付不時(shí)之需。在這里,我們以復(fù)制缺陷型重組腺病毒作為載體,制備了埃博拉和炭疽重組腺病毒,并在小鼠及大鼠模型上評(píng)價(jià)了它們的免疫原性。
　　對(duì)于埃博拉重組腺病毒疫苗,我們選擇了毒性最強(qiáng)的蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒作為研究對(duì)象,對(duì)疫苗的有效成份,蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白的基因進(jìn)行合成,并克隆入AdMax腺病毒系統(tǒng)的

2、穿梭質(zhì)粒pDC316上。通過(guò)將穿梭質(zhì)粒和AdMax腺病毒系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒(pBHGlox_E1,3Cre)共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,發(fā)生位點(diǎn)特異性重組,包裝出表達(dá)有埃博拉病毒包膜糖蛋白的復(fù)制缺陷型重組腺病毒疫苗候選株。對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增和純化,獲得一定的量,用于免疫學(xué)評(píng)價(jià)。
　　細(xì)胞免疫反應(yīng)是埃博拉病毒疫苗產(chǎn)生保護(hù)作用的關(guān)鍵,而CTL表位是評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)。為了篩選到適合于BALB/c小鼠的CTL表位,我們首先通過(guò)各種表位預(yù)測(cè)軟

3、件,對(duì)蘇丹型和扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d單元型的CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè),并選擇最有可能的CTL表位進(jìn)行合成。使用ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)的方法,篩選到了第一個(gè)蘇丹型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d單元型的CTL表位RF-9,同時(shí)篩選到了一個(gè)新的扎伊爾型埃博拉病毒包膜糖蛋白H-2d單元型的CTL表位GF-9。實(shí)驗(yàn)證實(shí),GF-9比之前報(bào)道過(guò)的CTL表位LV-9具有更高的靈敏性。在此基礎(chǔ)上,我們使用類似的方法,在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因

4、小鼠上成功篩選到了第一個(gè)蘇丹型埃博拉病毒包膜糖蛋白HLA-A*0201特異的CTL表位CV-9。埃博拉病毒包膜糖蛋白CTL表位的篩選為基于包膜糖蛋白的埃博拉病毒疫苗細(xì)胞免疫水平的評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
　　我們以BALB/c小鼠作為動(dòng)物模型,對(duì)埃博拉重組腺病毒進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。首先,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISPOT的方法,驗(yàn)證了蘇丹型和扎伊爾型埃博拉重組腺病毒均可誘導(dǎo)產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在體液免疫反應(yīng)方面,重組腺病毒免疫后小鼠血清

5、的抗體在近一年的時(shí)間內(nèi)可穩(wěn)定維持。隨后,我們將蘇丹型和扎伊爾型埃博拉重組腺病毒混合后進(jìn)行免疫,結(jié)果顯示,兩者均能產(chǎn)生特異而強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng),說(shuō)明兩者不存在相互干擾作用,可以混合使用。同時(shí),我們對(duì)IFN-γ陽(yáng)性的CD8細(xì)胞統(tǒng)計(jì)其分泌TNF和IL-2以及表達(dá)CD107的情況。結(jié)果顯示,雖然在IFN-γ陽(yáng)性的CD8細(xì)胞中IFN-γ單陽(yáng)性的細(xì)胞占40％左右。然而,IFN-γ、TNF、IL-2和CD107四陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比大于5%,而IFN

6、-γ、TNF、IL-2三陽(yáng)性的細(xì)胞百分比也大于10%。這一結(jié)果說(shuō)明,埃博拉重組腺病毒所激發(fā)的效應(yīng)T細(xì)胞中多功能細(xì)胞占有較大的比例。通過(guò)對(duì)埃博拉重組腺病毒不同免疫方式所產(chǎn)生的免疫效果進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌肉注射(IM)能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng),而滴鼻(IN)的免疫方式雖然在脾細(xì)胞上不能檢測(cè)到IFN-γ的分泌,但其血清抗體水平比肌肉注射的免疫方式要高。此外,滴鼻的免疫方式還能產(chǎn)生高水平的分泌型肺洗液IgA抗體。接著,我們對(duì)不同免疫方式的組合

7、進(jìn)行探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn),先肌肉注射后滴鼻免疫的免疫方式,既能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng),而且可以激發(fā)強(qiáng)烈的血清IgG抗體和肺洗液分泌型IgA抗體水平。在此基礎(chǔ)上,將扎伊爾型埃博拉病毒分泌型糖蛋白(sGP)的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并以此包裝重組腺病毒進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,密碼子優(yōu)化后,重組腺病毒的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平保持不變,但體液免疫反應(yīng)水平有明顯的增強(qiáng)。同時(shí),密碼子優(yōu)化后重組腺病毒免疫的小鼠產(chǎn)生抗體的時(shí)間明顯提前。
　　在炭疽重組腺

8、病毒疫苗方面,通過(guò)密碼子優(yōu)化,使疫苗的有效成份保護(hù)性抗原PA在真核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。使用流式細(xì)胞術(shù)和ELISPOT的方法對(duì)炭疽保護(hù)性抗原PA的CTL表位進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)H-2d單元型的CTL表位NA-9,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)HLA-A*0201特異的CTL表位AV-9和FI-9。實(shí)驗(yàn)證實(shí)肌肉注射炭疽重組腺病毒可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在體液免疫方面,無(wú)論是肌肉注射還是滴鼻免疫,均可產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的血清抗體水平和抗炭疽毒素中和

9、抗體水平。其中肌肉注射可更快的產(chǎn)生免疫反應(yīng),其血清主要抗體亞型為IgG2a;而滴鼻免疫所產(chǎn)生的血清IgG抗體峰值略高于肌肉注射,其主要抗體亞型為IgG1。使用對(duì)炭疽毒素敏感的Fisher344大鼠進(jìn)行炭疽毒素攻毒實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉注射108ifu的炭疽重組腺病毒7天以后進(jìn)行10倍LD50的炭疽毒素攻擊即可實(shí)現(xiàn)100%的保護(hù)效果,充分證明了該疫苗在緊急預(yù)防方面的優(yōu)勢(shì)。
　　由于預(yù)存免疫是人5型腺病毒載體疫苗必需要考慮的一個(gè)問(wèn)題,我們

10、分別以肌肉注射和滴鼻的方式給予預(yù)存免疫對(duì)炭疽重組腺病毒的免疫效果進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),預(yù)存免疫對(duì)滴鼻免疫方式的影響并不是很大;肌肉注射給予預(yù)存免疫會(huì)影響肌肉注射的免疫效果,而滴鼻預(yù)存對(duì)肌肉注射影響較小。自然情況下腺病毒通常是經(jīng)粘膜系統(tǒng)進(jìn)行感染,這很大程度上說(shuō)明了在自然感染人5型腺病毒的情況下,經(jīng)肌肉注射接種重組腺病毒載體疫苗仍然具有很好的效果。在滴鼻給予預(yù)存免疫的情況下,大鼠經(jīng)肌肉注射免疫炭疽重組腺病毒15天后進(jìn)行炭疽毒素攻擊也可以實(shí)現(xiàn)1