血瘀和脂毒與糖脂代謝紊亂的關(guān)系及活血降糖飲的治療作用.pdf

1、目的:
　　一、臨床研究部分:
　　本部分研究通過比較血瘀證與非血瘀證2型糖尿病患者血清游離脂肪酸水平和游離脂肪酸譜的變化，及其與血瘀證證候積分、糖尿病大血管并發(fā)癥的相關(guān)性，并分析血瘀證2型糖尿病患者血漿代謝組分及代謝途徑的差異，探討脂毒和血瘀在2型糖尿病中的可能關(guān)系及其所引起的病理生理變化，為中醫(yī)藥對(duì)糖脂紊亂及相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　本部分研究旨在探討具有活血通絡(luò)，益氣養(yǎng)陰作用

2、的活血降糖飲對(duì)脂毒性損傷所導(dǎo)致的大鼠胰島素抵抗、血脂紊亂、胰島β細(xì)胞凋亡、胰腺蛋白質(zhì)組變化和大鼠胰島素瘤細(xì)胞系（INS-1細(xì)胞系）胰島素分泌障礙的治療作用和可能的分子機(jī)制，從脂毒性所導(dǎo)致的胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞凋亡、胰島素分泌障礙等參與糖脂代謝紊亂病理生理變化的多個(gè)角度，探討活血降糖飲對(duì)脂毒性損傷的治療作用和可能的機(jī)制。
　　方法:
　　一、臨床研究部分:
　　在2014年6月至2014年12月我院住院病人中收集血瘀證

3、與非血瘀證且符合2型糖尿病診斷的患者各25例，觀察2組患者基本情況、血瘀證證候積分及血糖、血脂等生化指標(biāo)的差異，用酶聯(lián)免疫(Elisa)法檢測(cè)炎癥因子白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-18（IL-18），用彩超檢測(cè)2組患者大血管病變情況，分析與血瘀證證候積分相關(guān)的因素;并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)，研究2組患者血清游離脂肪酸譜的差異，分析血清游離脂肪酸與血瘀證證候積分、大血管病變的相關(guān)性。同時(shí)

4、，運(yùn)用核磁共振波譜技術(shù)（NMR）定量檢測(cè)血瘀證與非血瘀證2型糖尿病患者血漿代謝物含量，通過主成分分析方法分析造成2組患者代謝組分不同的主要因素，并以此推斷2組患者可能存在差異的代謝通路。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　通過液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)初步檢測(cè)活血降糖飲煎劑所含化學(xué)成分。采用高脂高熱卡飲食喂養(yǎng)28周的方法建立大鼠胰島素抵抗、高脂血癥模型，將大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、貝特組，各治療組分別給與相應(yīng)藥物灌胃治療，另設(shè)正

5、常對(duì)照組，干預(yù)8周后，觀察各組大鼠口服葡萄糖糖耐量試驗(yàn)(OGTT)、胰島素釋放試驗(yàn)(IRT)、血脂(TC、TG、LDL-c、HDL-c)、FFA、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、肝臟脂肪含量差異，肝臟組織學(xué)檢查，Western blot方法檢測(cè)各組大鼠肝臟及脂肪組織胰高糖素樣肽-1受體（GLP-1R）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4（GLUT-4）蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，觀察各組大鼠胰腺脂肪含量差異，進(jìn)行胰腺組織學(xué)檢查，透射電

6、鏡觀察胰腺超微結(jié)構(gòu)，TUNEL法觀察大鼠胰島β細(xì)胞凋亡情況，分析胰腺脂肪含量和β細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性，Western blot方法檢測(cè)各組大鼠胰腺B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達(dá)水平。并應(yīng)用iTraq定量蛋白質(zhì)組學(xué)觀察各組大鼠胰腺蛋白質(zhì)組的變化情況，篩選可能與凋亡和脂質(zhì)代謝相關(guān)的差異表達(dá)的蛋白，用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行初步驗(yàn)證。最后，用0.25mmol/L棕櫚酸(PA)干預(yù)INS-1細(xì)胞48h，建立高

7、脂誘導(dǎo)的胰島素分泌缺陷模型，分為模型組、高劑量組（20％含藥血清）、中劑量組（10％含藥血清）和低劑量組（5％含藥血清），給與相應(yīng)藥物干預(yù)，另設(shè)正常對(duì)照組，Elisa法檢測(cè)各組INS-1細(xì)胞葡萄糖+GLP-1刺激后的胰島素分泌情況，以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度，Western blot方法檢測(cè)葡萄糖+GLP-1刺激后各組細(xì)胞內(nèi)GLP-1R、環(huán)磷酸腺苷直接激活交換蛋白（Epac-2）、蛋白激酶B(Akt)、pAkt(Ser473)

8、蛋白表達(dá)。
　　成果:
　　一、臨床研究部分:
　　（一）血瘀證2型糖尿病患者血瘀證證候積分、總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、IL-6、TNF-α、IL-18、頸動(dòng)脈斑塊發(fā)現(xiàn)率、股總動(dòng)脈斑塊發(fā)現(xiàn)率、總血管斑塊發(fā)現(xiàn)率、頸動(dòng)脈平均中-內(nèi)膜厚度、頸動(dòng)脈斑塊面積、股總動(dòng)脈斑塊面積均明顯高于非血瘀證患者（P＜0.05）;
　?。ǘ┫嚓P(guān)性分析發(fā)現(xiàn)患者年齡、糖尿病病程、平均中-內(nèi)膜厚度

9、、頸動(dòng)脈板塊面積、股總動(dòng)脈板塊面積與血瘀證癥候積分呈正相關(guān)，其他因素與證候積分無明顯相關(guān)性(P＞0.05);
　　（三）在兩組患者的血清中，共檢測(cè)出21種脂肪酸，造成兩組患者血清游離脂肪酸譜差異的因素主要是總游離脂肪酸(TFFA)、飽和脂肪酸(SFA)、月桂酸(C12∶0)、棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生四烯酸(C20∶4n6)、山崳酸(22∶0)和二十四烷酸(C24∶0);
　　（四）相關(guān)性分析表明:月桂酸

10、(C12∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、山崳酸(C22∶0)、TFFA、SFA與血瘀證證候積分呈正相關(guān)（P＜0.05），而其他脂肪酸與血瘀證無明顯相關(guān)性（P＞0.05），多重線性回歸分析只有SFA進(jìn)入回歸方程;
　?。ㄎ澹┰鹿鹚?C12∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生四烯酸(C20∶4n6)、TFFA、SFA與頸動(dòng)脈斑塊面積呈正相關(guān)(P＜0.05)，亞麻酸(C18∶3n3)、順式-5，8

11、，11，14，17-二十碳五烯酸(C20∶5n3)與頸動(dòng)脈斑塊面積呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，棕櫚酸(C16∶0)與股總動(dòng)脈斑塊面積呈正相關(guān)(P＜0.05)，亞麻酸(C18∶3n3)、順式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六酸(C22∶6)、神經(jīng)酸(C24∶1)與股總動(dòng)脈斑塊面積呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);
　?。┩ㄟ^NMR，在2組患者中，共檢測(cè)出47中代謝物，2組患者代謝物組組成有重疊，但能相互區(qū)分;
　?。ㄆ撸┭?/p>

12、瘀證2型糖尿病患者丙酮、乙酰乙酸、α-羥基丁酸、α-羥基異戊酸、β-羥基丁酸、α-酮基異己酸鹽、3-甲基-2-氧代戊酸甲酯、3-羥基異丁酸、甘氨酸高于非血瘀證T2DM患者(P＜0.05)，而延胡索酸、檸檬酸、N-乙酰鳥氨酸、焦谷氨酸、蛋氨酸低于非血瘀證T2DM患者（P＜0.05），其他33種代謝組分在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　（一）對(duì)活血降糖飲煎劑成分的初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)活血降糖飲煎劑

13、含有大量黃酮類和丹參酮類物質(zhì);
　?。ǘ┰谝葝u素抵抗和肝臟及脂肪GLP-1R、GLUT-4蛋白表達(dá)方面:與正常組比較，模型組大鼠OGTT及IRT異常、體重、TC、TG、LDL-c、HOMA-IR、FFA、肝臟脂肪含量明顯升高（P＜0.05），HDL-c、ISI明顯下降（P＜0.05），肝臟見明顯脂肪沉積，與模型組相比，中藥組和貝特組OGTT及IRT改善，TC、TG、LDL-c、HOMA-IR、FFA、肝臟脂肪含量明顯降低（P＜0

14、.05），ISI明顯升高（P＜0.05），肝臟脂肪含量明顯減少(P＜0.05)，肝臟脂肪沉積明顯改善，HDL-c改善不明顯。與正常組相比，模型組大鼠肝臟GLP-1R、GLUT-4，脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），脂肪組織GLP-1R蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，與模型組相比，中藥組和貝特組大鼠肝臟GLP-1R、GLUT-4，脂肪組織GLUT-4蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而脂肪組織GLP-1R蛋白表達(dá)無明顯差異(

15、P＞0.05)。
　?。ㄈ┰谝葝uβ細(xì)胞凋亡方面:與正常組比較，模型組大鼠胰腺脂肪含量明顯升高(P＜0.05)，胰腺可見明顯脂肪沉積，出現(xiàn)凋亡早期表現(xiàn)，胰島β細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05)，與模型組相比，中藥組和貝特組胰腺脂肪含量明顯減少（P＜0.05），胰腺脂肪沉積明顯改善，胰島β細(xì)胞凋亡明顯減少。相關(guān)性分析表明胰島β細(xì)胞凋亡指數(shù)與胰腺脂肪含量呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.993，P=0.004）。與正常組相比，模型組大鼠胰腺Bcl

16、-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），而中藥組和貝特組大鼠胰腺Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），Bax蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)。
　?。ㄋ模┰谝认俳M織蛋白質(zhì)組方面:模型組比正常組上調(diào)的蛋白有41個(gè)，下調(diào)24個(gè)，經(jīng)中藥治療后上調(diào)的蛋白有28個(gè)，下調(diào)的蛋白有26個(gè)，其中18個(gè)蛋白表達(dá)差異具有一致性（在模型組中表達(dá)上調(diào)/下調(diào)和在中藥組中下調(diào)/上調(diào)，稱為表達(dá)差異具有一致性）其中模型

17、組vs.正常組上調(diào)，經(jīng)中藥治療后下調(diào)的蛋白共有12個(gè)，模型組vs.正常組下調(diào)，經(jīng)中藥治療后上調(diào)的蛋白共有6個(gè)。經(jīng)篩選及免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠烯酰輔酶A水合酶/3-羥氨基輔酶A脫氫酶(Ehhadh)、固醇攜帶蛋白（Scp-2）及脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FATP-1）表達(dá)增加，與模型組相比，中藥組Ehhadh、Scp-2、FATP-1蛋白表達(dá)均減少。
　?。ㄎ澹┰讦录?xì)胞胰島素分泌方面:MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20％含藥血清濃度為最佳濃度。與正

18、常組相比，模型組細(xì)胞高糖+GLP-1刺激后，胰島素分泌明顯減少（P＜0.01），而經(jīng)過不同濃度含藥血清干預(yù)后，高糖+GLP-1刺激后，胰島素分泌明顯增加（P＜0.01），與高劑量組相比，低劑量組高糖+GLP-1刺激后，胰島素分泌減少（P＜0.01）。與正常組相比，模型組細(xì)胞高糖+GLP-1刺激后，GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，cAMP含量下降（P＜0.01），與模型組相比，三個(gè)濃度含藥血清

19、組cAMP含量明顯升高(P＜0.01)，高劑量和中劑量組GLP-1R、Epac-2、Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）高劑量組pAkt(Ser473)蛋白表達(dá)上調(diào);中劑量組pAkt(Ser473)、低劑量組GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）;與高劑量組比較，低劑量組cAMP含量、GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。<

20、br>　　結(jié)論:
　　一、臨床研究部分:
　　血瘀證與非血瘀證2型糖尿病患者血清游離脂肪酸水平、游離脂肪酸譜組成以及血漿代謝組分均存在差異。造成游離脂肪酸譜差異的主要因素是中長鏈飽和脂肪酸，血清游離脂肪酸譜和血瘀證癥候積分以及糖尿病大血管病變存在相關(guān)關(guān)系，飽和脂肪酸是血瘀證癥候積分的危險(xiǎn)因素;同時(shí)，血瘀證2型糖尿病患者存在更嚴(yán)重的脂代謝紊亂，和能量代謝障礙，在氨基酸代謝途徑中也存在差異。因此，脂毒和血瘀在2型糖尿病患者中存在

21、相關(guān)關(guān)系，二者相互影響，均是2型糖尿病發(fā)生與進(jìn)展中的重要病理生理變化過程。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　活血降糖飲對(duì)脂毒性損傷的治療作用具有多靶點(diǎn)，多作用機(jī)制的特點(diǎn)，其對(duì)脂毒性所致大鼠胰島素抵抗、高脂血癥、β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌障礙等多個(gè)病理生理改變均具有一定治療作用，具體作用機(jī)制如下:
　　（一）活血降糖飲對(duì)脂毒性所導(dǎo)致的大鼠胰島素抵抗和高脂血癥的治療可能與調(diào)節(jié)肝臟GLP-1R、GLUT-4和脂肪GLUT-4蛋白表達(dá)

22、相關(guān)。
　　（二）活血降糖飲預(yù)防脂毒性所致大鼠胰島細(xì)胞凋亡的作用可能與調(diào)節(jié)胰腺Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。
　?。ㄈ┙?jīng)長時(shí)間高脂高熱卡飲食喂養(yǎng)以及經(jīng)活血降糖飲治療后，大鼠胰腺蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，發(fā)生改變的蛋白可能主要參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化。
　?。ㄋ模┗钛堤秋嫼幯鍖?duì)脂毒性所致INS-1細(xì)胞高糖+GLP-1刺激后的胰島素分泌缺陷的治療作用可能與增加GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)