采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞因子篩選及IL-8在乳腺癌侵襲和血管生成中作用的研究.pdf

1、目的:利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)鑒定人類乳腺癌進(jìn)展中的關(guān)鍵因子.運(yùn)用人類細(xì)胞抗體芯片技術(shù)分析11株人類乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜,并進(jìn)一步研究細(xì)胞因子在乳腺癌進(jìn)展中的作用機(jī)制.研究?jī)?nèi)容和方法:研究材料包括11種乳腺癌細(xì)胞株:MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-468、SKBr-3、BT-20、BT-474、BT-549、T47D、ZR75-1、Hs587T、MCF-7細(xì)胞株以及35種細(xì)胞因子.第一部分蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析乳腺

2、癌細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)譜.開始實(shí)驗(yàn)前收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液.將培養(yǎng)細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌,以0.25％胰酶/EDTA消化后,按1×10<'6>個(gè)細(xì)胞/盤密度培養(yǎng)于100mm的細(xì)胞培養(yǎng)盤內(nèi).細(xì)胞首先在8ml含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中增殖48小時(shí),PBS洗滌細(xì)胞兩次,更換8ml含有0.2%牛血清的DMEM培養(yǎng)液.48小時(shí)后,收集細(xì)胞上清液,離心1000g去除細(xì)胞碎片,分裝并儲(chǔ)存于一80℃,直至進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn).同時(shí),收集細(xì)胞并測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,

3、實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度標(biāo)化細(xì)胞上清液.第二部分IL-8在乳腺癌細(xì)胞侵襲、血管生成和增殖中的作用.乳腺癌細(xì)胞體外侵襲能力的測(cè)定在重建基底膜的12孔板Transwell小室中進(jìn)行.Matrigel 30μl用不含血清的DMEM培養(yǎng)基1:1稀釋(總量60μl),加入Transwell小室的多孔聚碳酯膜上表面(膜孔徑12.0 μm),室溫下通風(fēng)櫥中干燥1小時(shí).將不同細(xì)胞株的細(xì)胞用PBS洗3次,消化后重懸于含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中,取4

4、×10<'5>/ml細(xì)胞0.5ml加入至上室,1.5ml 10%FCS的DMEM培養(yǎng)基加入下室.37℃、5%C0<,2>條件下培養(yǎng)24小時(shí),4%甲醇固定后行Gimsa染色.去除濾膜上層細(xì)胞,顯微鏡下(×320)計(jì)數(shù)濾膜下表面的侵襲了基底膜的細(xì)胞數(shù),隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目,以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目來表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力.第三部分ER對(duì)乳腺癌細(xì)胞IL-8的表達(dá)調(diào)控研究.利用細(xì)胞上清液芯片實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞和ER-α轉(zhuǎn)染的M

5、DA-MB-231細(xì)胞IL-8的表達(dá)差異.4℃下將40μg/ml的抗IL-8抗體包被hybond ECL膜4小時(shí),室溫干燥.接著,將0.2μ1不同來源的細(xì)胞上清點(diǎn)樣于膜上.細(xì)胞上清液膜在5%BSA/TBS中封閉非特異性位點(diǎn)1小時(shí)后,與生物素標(biāo)記的抗IL-8抗體混合液孵育1.5小時(shí).經(jīng)過3次0.1%Tween20/TBS和2次TBS震蕩洗滌,最后將芯片膜與2.5ng/ml HRP-Streptavidin孵育1小時(shí).同樣的洗滌條件去除未結(jié)

6、合的HRP-Streptavidin.ECL法顯示信號(hào).β-雌二醇實(shí)驗(yàn)是在MDA-MB-231原代細(xì)胞和S30培養(yǎng)基中加入2nM β-雌二醇,收集細(xì)胞上清液并進(jìn)行細(xì)胞上清液芯片實(shí)驗(yàn).采用FuGENE 6轉(zhuǎn)染法將ER-α及IL-8啟動(dòng)子pN1481 Luc或p Luc0轉(zhuǎn)染至人類乳腺癌細(xì)胞,同時(shí)共轉(zhuǎn)染HSV-TK表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK作為測(cè)定轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參對(duì)照.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ER-α對(duì)IL-8啟動(dòng)子的調(diào)控作用.結(jié)論:1.人類乳腺癌細(xì)