IL-8對(duì)不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響以及肝癌和乳腺癌中IL-8與EGFR信號(hào)通路的關(guān)系.pdf

1、一、研究背景及目的: IL-8屬于趨化因子超家族中的一個(gè)成員，是～種內(nèi)源性和多源性細(xì)胞因子，因其能激活和趨化中性粒細(xì)胞而被發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。1 990年Modi用原位雜交將IL-8基因定位于人染色體4q12-21，全長(zhǎng)5191 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。根據(jù)氨基酸序列分析，IL-8分子量(SDS．PAGE)為8Kda，其成熟形式有5種，分別由79個(gè)、77個(gè)、72個(gè)、70個(gè)和69個(gè)氨基酸殘基組成。應(yīng)用重組技術(shù)

2、，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)IL-8基因而得到的主要形式的IL-8是由72個(gè)氨基酸殘基組成。關(guān)于IL-8基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，目前的文獻(xiàn)主要集中于其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。在IL-8啟動(dòng)子上有多個(gè)位點(diǎn)可結(jié)合幾種不同的轉(zhuǎn)錄因子，其中有兩個(gè)區(qū)域?qū)L-8的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)非常重要，它們分別是遠(yuǎn)端結(jié)合AP．1的位點(diǎn)和近端結(jié)合NF-K B及NF-IL-6的位點(diǎn)。這些結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上緊密相關(guān)，功能上相互作用，是調(diào)節(jié)IL-8啟動(dòng)子功能的主要順式作用元件。在許多類型細(xì)胞

3、中都已證實(shí)IL-8基因的表達(dá)需要這些元件之間高度的協(xié)同以達(dá)到有效的轉(zhuǎn)錄。 IL-8是一種糖蛋白，與受體結(jié)合后發(fā)生作用。IL-8受體(IL-8receptor，IL-8R)是一個(gè)由59 Kda和67 Kda亞單位組成的二聚體糖蛋白，屬于7跨膜區(qū)G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)家族，CD編號(hào)為CDw128，存在于多種類型的細(xì)胞膜上，甚至包括一些不表達(dá)IL-8的細(xì)胞。IL-8與受體結(jié)合引起的反應(yīng)主要是通過(guò)細(xì)胞膜上G蛋白耦聯(lián)的磷脂酰肌醇途徑產(chǎn)

4、生的。IL-8受體與百日咳毒素(PTX)敏感的GTP結(jié)合蛋白耦合，激活磷脂酶Cβ(PLC<,β>)，將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP<,2>)分解為三磷酸肌醇(IP<,3>)和二酰甘油(DG)，同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)胞內(nèi)第二信使，分別激動(dòng)兩個(gè)信號(hào)傳遞途徑即IP<,3>/Ca<'2+>和DG/PKC通路：IP<,3>通過(guò)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異的受體使其內(nèi)部Ca<'2+>釋放，引起胞內(nèi)Ca<'2+>水平的增加，從而啟動(dòng)胞內(nèi)Ca<'2+>信號(hào)系統(tǒng)，即

5、通過(guò)依賴Ca<'2+>、鈣結(jié)合蛋白的酶類活性變化來(lái)調(diào)節(jié)生理過(guò)程；DG則通過(guò)激活PKC，以磷酸化的形式對(duì)許多蛋白質(zhì)和酶類進(jìn)行修飾，從而調(diào)節(jié)和控制另外一系列的生理過(guò)程。在這兩個(gè)信號(hào)傳遞途徑中，參與細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞的生長(zhǎng)分化以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的主要是DG/PKC通路。目前已知至少有兩種不同類型的IL-8R，Ⅰ型受體(CXCRl)特異性地與IL-8結(jié)合，Ⅱ型受體(CXCR2)除了與IL-8結(jié)合外，還可以和生長(zhǎng)相關(guān)癌基因(GR0)、單核細(xì)

6、胞炎性蛋白-2(MIP-2)和中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2)等結(jié)合。編碼兩種類型IL-8R的cDNAs已從中性粒細(xì)胞中克隆并被分離，這兩種類型的受體由位于人染色體2q 34-2q3 5的單拷貝基因編碼，兩者之間cDNAs編碼的氨基酸序列約有77﹪是相同的。腫瘤發(fā)展與血管生成密不可分，自從Koch等人發(fā)現(xiàn)IL-8與血管生成有關(guān)以來(lái)，人們開始注意到IL-8與腫瘤的關(guān)系。如在胰腺癌、惡性間皮瘤、結(jié)腸癌、黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)它可以作為自分泌生長(zhǎng)因

7、子而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌等腫瘤中則發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，可能是通過(guò)促進(jìn)膠原酶的活性、影響細(xì)胞的粘附移動(dòng)及血管生成所致。但也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用：Lee等人發(fā)現(xiàn)JL-8轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞體外試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)并沒(méi)有影響，但是注入小鼠體內(nèi)后則抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而注入IL-8的中和抗體后腫瘤生長(zhǎng)又恢復(fù)，認(rèn)為這種抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用是由注射部位聚集的大量中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的。而且，泰素

8、抑制卵巢腫瘤的作用與它上調(diào)IL-8表達(dá)從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞也可分泌IL-8，但是關(guān)于肝癌細(xì)胞是否表達(dá)IL-8R以及表達(dá)哪種受體(CXCR 1 or CXCR2)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究擬就上述問(wèn)題以及IL-8分泌與肝癌轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系、IL-8及其中和抗體對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響進(jìn)行初步探討。 EGFR是研究最為深入的生長(zhǎng)因子受體，約三分之一的上皮性腫瘤高表達(dá)EGFR，其中也包括乳腺癌和肝癌，其過(guò)度表達(dá)往

9、往提示腫瘤患者預(yù)后較差。EGFR可通過(guò)兩個(gè)不同的途徑活化，一個(gè)是配體依賴途徑：即配體與EGFR結(jié)合后，激活EGFR自身酪氨酸激酶活性，使胞內(nèi)激酶區(qū)的數(shù)個(gè)酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生自身磷酸化。EGFR的配體主要有EGF和TGF-α，還有Epiregulin、β-cellulin、HB-EGF、Amphiregulin(AR)及epigen，其自身磷酸化位置多在C末端尾部，主要位置是1173、1148和1068等位的Tvr。另一個(gè)途徑就是非配體依賴途徑

10、，也稱為轉(zhuǎn)活(transactivation)：即當(dāng)受到H<,2>O<,2>、紫外線、滲透應(yīng)力、乙酰膽堿受體、生長(zhǎng)激素等刺激后EGFR發(fā)生自身磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)GPCR配體如凝血酶、溶血磷脂酸、內(nèi)皮素、I等也可誘導(dǎo)EGFR的轉(zhuǎn)活，提示GPCR信號(hào)通路與EGFR信號(hào)通路之間的cross-talk，作為GPCR配體之一的IL-8是否也有這種作用自然引起了人們的興趣。Schraufstatter等人發(fā)現(xiàn)IL-8可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EGFR的轉(zhuǎn)活，這一

11、過(guò)程是由CXCR2介導(dǎo)的并且依賴于組織蛋白酶B的活性。在胃癌及結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)I-．8誘導(dǎo)了EGFR配體HB-EGF的脫落及EGFR的酪氨酸磷酸化，這一過(guò)程是由ADAM介導(dǎo)的。Venkatakrishnan等人在卵巢癌中的研究發(fā)現(xiàn)IL-8誘導(dǎo)了與Grb2有關(guān)的一些蛋白的磷酸化，其中就包括EGFR和銜接蛋白Shc的亞型，并且EGFR的轉(zhuǎn)活依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度的增加。在乳腺癌和肝癌中是否也存在著兩種信號(hào)通路之間的cross-ta

12、lk是本研究的重點(diǎn)。 二、研究方法: 本研究分為兩部分：1．探討IL-8是否是肝癌的自分泌生長(zhǎng)因子及IL-8分泌與肝癌轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系：采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞、MHCC97-L(低轉(zhuǎn)移潛能)及MHCC97-H(高轉(zhuǎn)移潛能)三種肝癌細(xì)胞IL-8分泌的差異：免疫細(xì)胞化學(xué)方法(ICC)檢測(cè)三株癌細(xì)胞膜表面是否表達(dá)IL-8受體，以及表達(dá)哪種受體(CXCRl OrCXCR2)；MTT和matrigel inv

13、asion方法分析rhIL-8及anti-IL-8對(duì)癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響。2．探討肝癌和乳腺癌中IL-8與EGFR信號(hào)通路之間是否存在cross-talk：ELISA方法檢測(cè)rhEGF和anti-EGFR對(duì)肝癌和乳腺癌IL-8分泌的影響；western blot方法分析rhIL-8及anti-IL-8對(duì)EGFR酪氨酸磷酸化的影響。三、研究結(jié)果1、三株肝癌細(xì)胞均有IL-8分泌；其細(xì)胞膜表面均有IL-8受體的表達(dá)，且均表達(dá)兩種受體(CXC

14、R1及CXCR2)；雖然高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞其IL-8分泌比低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞多，但三組比較均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、rhIL-8及其中和抗體對(duì)三株肝癌細(xì)胞的增殖均無(wú)明顯影響，但可影響三株肝癌細(xì)胞的侵襲能力：rhIL-8可提高癌細(xì)胞的侵襲活性(P<0.05)，其中和抗體則對(duì)癌細(xì)胞的侵襲有抑制作用(P<0.05)。 3、rhEGF及anti-EGFR均抑制了乳腺癌細(xì)胞IL-8的分泌(P<0.05；P<0.01)，而rhIL-8

15、對(duì)乳腺癌細(xì)胞EGFR的活化并無(wú)明顯影響，相反anti-IL-8卻誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞EGFR的活化。 4、rhEGF對(duì)肝癌細(xì)胞IL-8的分泌有促進(jìn)作用(P<0.05)，anti-EGFR對(duì)肝癌細(xì)胞IL-8的分泌有抑制作用(P<0.01)，而rhIL-8及anti-IL-8對(duì)肝癌細(xì)胞EGFR的活化均無(wú)明顯影響。 四、結(jié)論: 1、雖然肝癌細(xì)胞可分泌大量IL-8，也表達(dá)IL-8受體，但是IL-8并不是肝癌的自分泌生長(zhǎng)因子，

16、IL-8的分泌與肝癌的轉(zhuǎn)移潛能也沒(méi)有關(guān)系：IL-8通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲而影響肝癌的發(fā)展。 2、肝癌及乳腺癌細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)IL-8可誘導(dǎo)EGFR的轉(zhuǎn)活，但是乳腺癌中anti-IL-8卻誘導(dǎo)了EGFR的轉(zhuǎn)活，提示乳腺癌中GPCR介導(dǎo)的IL-8信號(hào)通路與EGFR信號(hào)通路之間并無(wú)cross-talk，而是競(jìng)爭(zhēng)抑制的關(guān)系。 3、肝癌及乳腺癌細(xì)胞中anti-EGFR均可明顯抑制IL-8的釋放，為anti-EGFR與anti-IL-