MUSTN1和PDK4基因在家禽肌肉組織發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、完善的禽類肌肉發(fā)育機制是家禽肌肉性狀分子育種過程中的理論依據(jù)。本研究采用胚盤下腔注射法向種蛋注射重組干擾質(zhì)粒的手段，沉默MUSTN1和PDK4基因的表達。通過實時熒光定量PCR檢測基因的差異表達情況，探討MUSTN1和PDK4基因在肌肉發(fā)育過程中潛在的功能及其調(diào)控機制。具體結果如下：
　　(1)根據(jù)shRNA的設計原則設計干擾片段，經(jīng)測序后確定成功構建重組干擾質(zhì)粒pEGFP-C2_shMUSTN1和pEGFP-C2_shPDK4。

2、通過凝膠阻滯實驗確定重組干擾質(zhì)粒/脂質(zhì)體的包裝比為1:2.5時包裝效果最好。
　　(2)經(jīng)免疫組化確定分離得到雞胚成纖維細胞。轉染及干擾效率檢測表明，不同包裝比的轉染液均成功轉染雞胚成纖維細胞，且包裝比為1:2.5時熒光信號最強。該結果與凝膠阻滯實驗相一致，固以此包裝比制備轉染液。實時熒光定量PCR結果顯示pEGFP-C2_shMUSTN1_1和pEGFP-C2_shPDK4_1重組質(zhì)粒干擾效率最高且與對照組存在極顯著差異(P<0

3、.01)。
　　(3)通過胚盤石蠟切片確定轉染液的注射量為2μl。發(fā)育6天胚胎基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示可以擴增出EGFP片段。發(fā)育2周的胚胎胸肌、心臟、肝臟和腎臟的石蠟切片結果顯示，在胸肌和肝臟中可以檢測到兩種重組干擾質(zhì)粒的熒光表達，在腎臟組織中可以檢測到pEGFP-C2_shPDK4_1的熒光表達。而PCR結果也顯示，在轉染兩種重組質(zhì)粒的胸肌和肝臟中，以及轉染pEGFP-C2_shPDK4_1的腎臟組織中可以擴增出E

4、GFP片段，進一步證明轉染成功。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，在被兩種重組干擾質(zhì)粒轉染的個體內(nèi)，第2、4、6和8周的目的基因相對表達水平顯著下調(diào)并與對照組存在極顯著差異(P<0.01)，干擾效率滿足實驗要求。
　　(4)實時熒光定量PCR對IGF-1、MyoD和MyoG的檢測結果顯示，MUSTN1的低表達會在胚胎發(fā)育的第14天引起IGF-1的極顯著下調(diào)表達(P<0.01)；MyoD和MyoG在第4天和第14天的極顯著下調(diào)表達(P

5、<0.01)；PDK4的低表達沒有導致在發(fā)育6天和14天的胚胎組織中IGF-1、MyoD和MyoG的表達水平出現(xiàn)顯著性變化。
　　根據(jù)上述實驗結果并結合現(xiàn)有家禽肌肉方面的研究進展得出如下結論：MUSTN1的低表達導致IGF-1下調(diào)從而對PI3K/Akt的激活效應減弱，引發(fā)FoxO1去磷酸化，進而調(diào)控MyoD和MyoG下調(diào)表達，即MUSTN1可能對MyoD和MyoG具有正向調(diào)節(jié)作用；PDK4不直接參與肌肉早期的增殖和分化過程，而是通