spoT基因在幽門螺桿菌定植過(guò)程中的功能研究.pdf

1、目的：
　　 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hpylori)是一個(gè)重要的人類病原菌，革蘭染色陰性、螺桿狀、微需氧菌，特異性寄生于胃粘膜，其感染可導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤及胃癌的發(fā)生，1994年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將其列為I類致癌因子。現(xiàn)在世界人口中大約一半被Hpylori感染，中國(guó)是感染的高發(fā)區(qū)，并且在不接受抗菌治療的情況下被感染者一般終生帶菌。盡

2、管如此，迄今為止Hpylori的傳播途徑和持續(xù)性感染機(jī)制還不明確，由此制約了針對(duì)Hpylori感染的預(yù)防和治療。
　　 Hpylori在定植于宿主胃粘膜細(xì)胞的過(guò)程中可誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，這一過(guò)程刺激宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧分子(ROS)和活性氮中介物(RNI)。雖然受到大量ROS/RNI的氧化刺激，Hpylori卻能夠成功地在胃粘膜定植并生存。這說(shuō)明Hpylori具有有效的適應(yīng)氧應(yīng)激系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)Hpylori具有較多抗氧應(yīng)

3、激的效應(yīng)基因，但調(diào)控基因卻較少，因此Hpylori抗氧應(yīng)激調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究表明宿主通過(guò)細(xì)胞免疫防御幽門螺桿菌感染，特別是巨噬細(xì)胞的吞噬作用，然而幽門螺桿菌可以有效的應(yīng)對(duì)細(xì)胞免疫特別是Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中vacA與尿素酶基因在其免疫逃逸中具有重要作用。然而，幽門螺桿菌免疫逃逸調(diào)控機(jī)制卻研究甚少。
　　 spoT基因是一個(gè)全局性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因，其功能最早發(fā)現(xiàn)是調(diào)控大腸桿菌的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答。所謂嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答是指細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)氨基酸饑餓

4、而發(fā)生的基因表達(dá)模式的劇烈變化也稱作“營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激應(yīng)答”?，F(xiàn)在將細(xì)菌在各種不利生存環(huán)境下發(fā)生的基因表達(dá)模式的改變統(tǒng)稱為“嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答”。在Hpylori基因組中也含有這個(gè)基因，最近研究發(fā)現(xiàn)在惡劣環(huán)境下，spoT基因也可以調(diào)控Hpylori的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答，但機(jī)制未明。Hpylori在宿主體內(nèi)定植過(guò)程中受到的氧應(yīng)激與吞噬可以看做一種嚴(yán)謹(jǐn)環(huán)境，因此我們的研究主要探討spoT基因在Hpylori在宿主體長(zhǎng)期定植適應(yīng)宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中所起的作用，并對(duì)觀察到的

5、現(xiàn)象作出初步解釋，為Hpylori的預(yù)防和治療提供線索。
　　 方法：
　　 1、將已構(gòu)建好的Hpylori spoT基因缺失突變株和野生株分別多次經(jīng)口感染蒙古沙鼠，分別于末次感染后的第2、4、6、8周脫頸處死蒙古沙鼠，取其胃粘膜組織進(jìn)行分離培養(yǎng)和革蘭染色初步鑒定細(xì)菌，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR絕對(duì)定量方法對(duì)Hpylori進(jìn)行鑒定和數(shù)量測(cè)定。
　　 2、用人外周血中免疫細(xì)胞分別刺激Hpylori spoT基因缺失突變

6、株和野生株，并取兩個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)：30分鐘和60分鐘。提取標(biāo)本RNA，反轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別測(cè)定比較它們抗氧應(yīng)激相關(guān)基因(sodB、katA、tasA、rocF)、毒力基因（cagA、vacA、napA）、降解受損蛋白相關(guān)基因(clpP、clpX在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中處死蒙古沙鼠時(shí)同時(shí)摘眼球取血，收集每次每組血清保存于-80C，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法測(cè)定并比較外周血液中的DNA氧化損傷標(biāo)志物8-

7、羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量，以此反應(yīng)不同菌株在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧的水平，間接反應(yīng)不同菌株感染誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫細(xì)胞的水平。
　　 4、用超氧化物陰離子熒光檢測(cè)探針DHE裝載人外周血的免疫細(xì)胞，Hpylori spoT基因缺失突變株和野生株分別作用于一定量的人外周血的免疫細(xì)胞不同時(shí)間后，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定比較不同菌株在體外產(chǎn)生活性氧水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Hpylori spoT基因缺失突變株和野生

8、株均可在蒙古沙鼠胃內(nèi)成功定植;H pylori spoT基因缺失突變株在蒙古沙鼠胃粘膜的定植能力明顯低于野生株，在第8周時(shí)甚至幾乎檢測(cè)不到突變株定植。
　　 2、spoT基因缺失突變株中大部分抗氧應(yīng)激基因(sodB、katA、tasA、rocF)、毒力基因(cagA、vacA、napA)在mRNA水平表達(dá)異常，兩個(gè)與降解受損蛋白相關(guān)的關(guān)鍵基因(clpP、clpX)表達(dá)降低。
　　 3、蒙古沙鼠感染Hpylori野生菌株組

9、(W組)與感染突變菌株組（M組）比較，末次感染后第2、4、6周蒙古沙鼠外周血中8-OHdG含量?jī)山M相差不大，但第8周M組明顯少于W組。
　　 4、在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：Hpylori野生菌株作用組均比spoT基因缺失突變菌株作用組產(chǎn)生活性氧多。
　　 結(jié)論：
　　 Hpylori spoT基因缺失突變株與野生株比較在宿主體內(nèi)定植力下降。但spoT突變株中與抗氧應(yīng)激力和生存力相關(guān)的大部分基因轉(zhuǎn)錄水平卻是上調(diào)的，