幽門螺桿菌外膜蛋白18識(shí)別干擾素gamma輔助幽門螺桿菌在胃部長(zhǎng)期定植.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的革蘭氏陰性菌，定植于全世界約一半的人體內(nèi)。在大部分帶菌者體內(nèi)，H.pylori感染引起的慢性胃炎是無(wú)癥狀的，但卻被認(rèn)為是十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃癌及黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤的主要致病因素。在不使用抗生素的情況下，H.pylori能夠持續(xù)定植于人體胃組織，表明宿主免疫反應(yīng)無(wú)效。同時(shí)，H.pylori耐藥

2、率不斷升高，多數(shù)抗生素已經(jīng)無(wú)法控制H.pylori感染的蔓延，因此，對(duì)于H.pylori免疫逃逸機(jī)制的研究顯得尤為重要。
　　H.pylori感染誘導(dǎo)胃竇部黏膜的慢性及活動(dòng)性炎癥反應(yīng)，并伴隨有B細(xì)胞、T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。雖然所有的H.pylori菌株都能夠引起胃炎，但是與cagA-的菌株相比，cagA+的H.pylori感染大大提高了嚴(yán)重性胃炎，萎縮性胃炎及胃癌的發(fā)病率，而且cagA+的H.pylori引起更強(qiáng)烈的IL-8的

3、分泌。胃上皮細(xì)胞在急慢性H.pylori感染的過(guò)程中起重要作用，H.pylori能夠激活胃上皮細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活信號(hào)通路的結(jié)果之一就是產(chǎn)生大量的IL-8。H.pylori引起的慢性活動(dòng)性胃炎的胃黏膜組織中大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)被認(rèn)為是對(duì)H.pylori的中性粒誘導(dǎo)因子（尿素酶，NapA）的應(yīng)答。
　　IFN-γ能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體抵抗細(xì)菌感染。IFN-γ激活免疫系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)包括吞噬作用及抗原提呈，誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞M

4、HCⅡ的表達(dá)并激活巨噬細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞，因此IFN-γ在免疫反應(yīng)中起重要作用。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)是IFN-γ信號(hào)通路的重要分子，IFN-γ能夠激活STAT1并提高其磷酸化水平，p-STAT1激活一氧化氮合酶(iNOS)并促進(jìn)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。NO作為IFN-γ信號(hào)通路的效應(yīng)分子，是宿主抵抗病原菌感染的基礎(chǔ)分子，能夠抑制對(duì)數(shù)期病原菌的生長(zhǎng)。
　　病原菌具有能夠與宿主相接觸的多種表面結(jié)構(gòu)（包括菌毛，鞭毛，外

5、膜蛋白以及多種分泌系統(tǒng)）用以調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附及入侵。革蘭陰性菌外膜蛋白是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，主要功能是輔助細(xì)菌適應(yīng)多變的外部環(huán)境。外膜蛋白能夠主動(dòng)的，有選擇性的控制重要物質(zhì)（多肽或蛋白質(zhì)，核酸以及脂質(zhì)、多糖等）的流入及排出。編碼H.pylori外膜蛋白的基因約有33種，大多數(shù)外膜蛋白位于膜的表面，其主要功能包括對(duì)宿主細(xì)胞的粘附及攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
　　雖然H.pylori引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)但是宿主免疫系統(tǒng)不能夠清除該菌，表明H.p

6、ylori具有免疫逃逸機(jī)制。H.pylori免疫逃逸機(jī)制包括誘導(dǎo)極化的免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)吞噬作用及中性粒細(xì)胞的功能以及抑制淋巴細(xì)胞增值。研究表明，H.pylori能夠結(jié)合IFN-γ并下調(diào)主要毒力因子CagA的表達(dá)。但是目前尚未有H.pylori結(jié)合IFN-γ的具體機(jī)制的相關(guān)報(bào)道，本論文通過(guò)基因芯片篩選出H.pylori外膜蛋白Omp18，并進(jìn)一步證實(shí)Omp18能夠結(jié)合IFN-γ輔助H.pylori長(zhǎng)期定植，有助于提高H.pylori在NO壓

7、力下的生存力及抗吞噬作用。
　　方法：
　　1.通過(guò)基因芯片方法篩選出H.pylori野生株在IFN-γ作用下發(fā)生表達(dá)變化的基因。用IFN-γ處理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的H.pylori野生株8h，未處理組作為對(duì)照，分別進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，通過(guò)比較找出IFN-γ作用下發(fā)生表達(dá)變化的基因。
　　2.通過(guò)Real-TimePCR法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。用IFN-γ處理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的H.pylori野生株，分別于0h，2h，4h，8h收集菌

8、液，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)Real-TimePCR檢測(cè)omp18的表達(dá)。
　　3.檢測(cè)H.pylori野生株毒力因子CagA、NapA在IFN-γ作用下的表達(dá)情況。H.pylori野生株及omp18突變株過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用IFN-γ處理8h，未處理組作為對(duì)照，收集菌液分別用于提取細(xì)菌總蛋白及RNA，通過(guò)westernblot及Real-TimePCR檢測(cè)毒力因子CagA、NapA的表達(dá)情況。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

9、。將H.pylori野生株及omp18突變株分別多次經(jīng)口感染蒙古沙鼠，分別于末次感染后第2，4，6，8周脫頸處死蒙古沙鼠，取其胃竇組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)檢測(cè)H.pylori定植情況，并通過(guò)H&E染色鑒定胃組織炎癥狀況，應(yīng)用Real-TimePCR及ELISA檢測(cè)胃組織炎性因子表達(dá)情況。
　　5.檢測(cè)H.pylori野生株及omp18突變株生存能力的差異。
　　(1)用硝普鈉(SNP)處理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的H.pylori野生株及

10、omp18突變株，分別通過(guò)瓊脂稀釋法及熒光染色法比較H.pylori野生株及omp18突變株的生存力。
　　(2)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H.pylori野生株及omp18突變株分別加入至培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的孔板中，分別于第2h，6h，24h裂解巨噬細(xì)胞并將含有H.pylori的裂解液經(jīng)梯度稀釋后涂布至瓊脂平板上，培養(yǎng)3-5天后計(jì)數(shù)單克隆。
　　6.通過(guò)免疫熒光的方法證實(shí)H.pylori外膜蛋白Omp18能夠結(jié)合IFN-γ。
　

11、　7.T-COFFEE軟件分析Omp18，OprF及干擾素結(jié)合區(qū)域蛋白序列。
　　8.通過(guò)westernblot比較H.pylori野生株與omp18突變株刺激后巨噬細(xì)胞p-STAT1蛋白的表達(dá)差異。
　　9.NO測(cè)定。將H.pylori感染后的巨噬細(xì)胞及沙鼠胃組織分泌的亞硝酸鹽的含量作為NO分泌的間接指標(biāo)并通過(guò)Griess反應(yīng)測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1.IFN-γ刺激下H.pyloriOmp18表達(dá)升高?；蛐?/p>

12、片發(fā)現(xiàn)與未處理的菌株相比，經(jīng)10ng/mLIFN-γ處理后H.pylori野生株Omp18表達(dá)升高。
　　2.T-COFFEE軟件分析發(fā)現(xiàn)Omp18序列與OprF序列以及干擾素gamma感受器1(IRF1)的干擾素結(jié)合域相似度很高。
　　3.免疫熒光證實(shí)IFN-γ能夠與H.pyloriOmp18結(jié)合。
　　4.IFN-γ下調(diào)H.pylori野生株毒力因子的表達(dá)。Westernblot及Real-TimePCR發(fā)現(xiàn)經(jīng)10

13、ng/mLIFN-γ處理后H.pylori野生株CagA及NapA表達(dá)下降，而omp18突變株中CagA及NapA表達(dá)上升。
　　5.H.pyloriomp18突變株在蒙古沙鼠胃組織中存在定植缺陷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明H.pylori野生株及omp18突變株均可在蒙古沙鼠胃部定植;omp18突變株在蒙古沙鼠胃組織的定植力明顯低于野生株，第8周差異最明顯。
　　6.H.pyloriomp18突變株感染誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。與野生株感染的

14、蒙古沙鼠相比，omp18突變株感染的蒙古沙鼠胃組織表現(xiàn)出更多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及更嚴(yán)重的組織損傷;Real-TimePCR及ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)omp18突變株誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃組織分泌更多的炎性因子;同樣，omp18突變株感染誘導(dǎo)AGS細(xì)胞分泌更多IL-8，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌更多MIP-2，特別是在IFN-γ存在時(shí)。
　　7.H.pyloriomp18突變株感染上調(diào)NO表達(dá)。在10ng/mLIFN-γ作用下，H.pylori野生株而非om

15、p18突變株能夠抑制巨噬細(xì)胞p-STAT1的表達(dá);而omp18突變株能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞以及蒙古沙鼠胃組織NO高表達(dá)。
　　8.Omp18有助于提高H.pylori野生株在氧應(yīng)激下的生存力及抗吞噬作用。在SNP刺激下，與H.pylori野生株相比，omp18突變株生存力急劇下降，且絕大多數(shù)突變株由正常的螺桿狀變?yōu)榍蛐?同樣，omp18突變株在巨噬細(xì)胞中生存力減弱。
　　結(jié)論：
　　H.pylori能夠通過(guò)Omp18主動(dòng)感應(yīng)