幽門螺桿菌cag致病島hp0521基因功能研究.pdf

1、目的：
　　hp0521基因是I型H. pylori攜帶的cag致病島中2號基因，目前國內(nèi)外對其研究僅僅停留于序列多樣性及對CagA轉(zhuǎn)運和IL-8的影響。本實驗針對H.pylori hp0521基因的多樣性和功能，從生物信息學、分子生物學等方面研究其在H.pylori致病機制中的作用。
　　方法：
　　1.對H.pylori NCTC11637及臨床菌株hp0521基因和cagA基因3，端可變區(qū)PCR擴增，測序。使用生

2、物信息學軟件分析hp0521基因基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建等方面，同時探討hp0521基因型與cagA可變區(qū)序列之間聯(lián)系。
　　2.依據(jù)HP菌株OM6004 hp0521基因，體外合成菌株26695補全兩個堿基后CDS（coding sequence），構(gòu)建表達載體pET-32a-hpc0521和pET-32a-hp0521，Western Blot分析IPTG誘導(dǎo)表達的融合蛋白。
　　3.分析H.pylori26695和

3、NCTC11637 hp0521基因序列抗原決定簇，合成具有強抗原性的多肽并免疫獲得抗體，測效價。
　　4.Western Blot驗證HP菌株26695中hp0521基因編碼的Cag2蛋白表達情況。
　　5.構(gòu)建pBlueKM40-?hp0521::kan自殺質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化，抗性篩選，PCR及測序驗證，獲得缺失株△hp0521。
　　6.測定相應(yīng)時間點的OD值，比較野生株26695和缺失株△hp0521生長情況。

4、r>　　7.提取野生株26695和缺失株△hp0521總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR法比較下游基因hp0522、hp0523極化情況。
　　8.網(wǎng)站預(yù)測及文獻查找hp0521互作基因，設(shè)計RT-PCR引物，比較其在mRNA水平上變化。
　　9.Western Blot驗證野生株26695和缺失株△hp0521中其他重要cagPAI編碼蛋白的穩(wěn)定性。
　　10.進行HP與細胞共培養(yǎng)實驗，探討CagA轉(zhuǎn)運和IL-8分泌兩者與hp

5、0521基因缺失的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.獲得HP菌株hp0521基因和cagA基因3，端可變區(qū)序列；hp0521基因編碼理化性質(zhì)穩(wěn)定且無信號肽的Cag2蛋白，結(jié)構(gòu)元件以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主；Cag2蛋白與DNA拓撲異構(gòu)酶I同源，有介導(dǎo)細胞壁延伸等蛋白標簽；進化樹分析分別獲得其同源菌株。
　　2.成功合成H.pylori26695補全堿基后的CDS；成功構(gòu)建原核表達載體pET-32a-hpc0521和pET-32

6、a-hp0521；成功驗證hpc0521基因轉(zhuǎn)錄翻譯Cag2蛋白。
　　3.成功制備效價是1:2.56×105的兔抗Cag2蛋白多克隆抗體。
　　4.用制備的抗體，Western Blot證明H.pylori菌株26695 hp0521基因在菌體內(nèi)不轉(zhuǎn)錄翻譯為Cag2蛋白。
　　5.成功構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40-?hp0521::kan；成功電轉(zhuǎn)化獲得缺失株：?hp0521。
　　6.繪制野生株26695和

7、缺失株△hp0521生長曲線，確定hp0521基因不影響菌株生長情況。
　　7.確定hp0521基因缺失后不影響hp0522、hp0523基因轉(zhuǎn)錄。
　　8.獲得hp0521互作基因為hp0116、hp0333、hp0440、hp0515、hp0516、hp0520、hp0792、hp1293、hp1324、rpoB、cagA、vacA、ureA、flaB，經(jīng)RT-PCR確定hp0521基因缺失后cagA、rpoB的mRNA

8、水平上調(diào)。
　　9.hp0521基因缺失后，cagPAI編碼的CagA蛋白表達量增加，CagX、CagM、CagL、CagS、CagI、CagV、Cagζ蛋白穩(wěn)定性無影響。
　　10.與GES-1共培養(yǎng)，缺失hp0521基因后CagA轉(zhuǎn)運和IL-8誘導(dǎo)無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.通過克隆、測序及分析了解HP菌株hp0521基因編碼的Cag2蛋白具有DNA拓撲異構(gòu)酶功能區(qū)，同時一般hp0521基因缺失的HP菌