間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株(K3)的腫瘤干性和轉(zhuǎn)移潛能實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變致瘤單克隆腫瘤細(xì)胞株(K3)的裸鼠轉(zhuǎn)移模型;經(jīng)多次裸鼠體內(nèi)傳代轉(zhuǎn)移后獲得具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株;探討高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株的腫瘤干性特征變化及可能機(jī)制。
　　 方法：大鼠問質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株(K3)以1×106細(xì)胞/只接種于BALB/c-nu裸鼠皮下、脾臟內(nèi)或脛骨端骨髓腔內(nèi),觀察腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤后,再重復(fù)致瘤一次后將肝和肺轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞體外原代培養(yǎng)擴(kuò)增,并經(jīng)有限稀釋后,獲

2、得了單克隆化的K3來源的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-F4)和肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-B6)。通過transwell實(shí)驗(yàn)分析K3-F4,K3-B6細(xì)胞體外遷移和侵襲能力,熒光定量RT-PCR及Westernblot分析這兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)情況,并通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將K3,K3-F4,K3-B6細(xì)胞標(biāo)記紅色熒光蛋白后經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi),活體成像觀察裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能。通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分析K3-F4,K3-B6細(xì)胞體外成球能力,Weste

3、rnblot檢測(cè)他們的干性基因表達(dá)水平,皮下致瘤實(shí)驗(yàn)觀察體內(nèi)致瘤能力。通過免疫熒光、Westernblot、熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析K3-F4,K3-B6細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：K3細(xì)胞株接種于BALB/c-nu裸鼠體內(nèi)30d左右,皮下注射組裸鼠各器官未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶,脾臟內(nèi)注射組裸鼠發(fā)生了肝臟轉(zhuǎn)移,骨髓腔注射組裸鼠發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。通過單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)獲得單克隆的肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-F4)和肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(K3-B6

4、)。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)及小動(dòng)物活體成像觀察到,K3-F4,K3-B6細(xì)胞與K3細(xì)胞株的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移潛能有很大差異(P＜0.05),K3-F4,K3-B6細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2,CXCR4的表達(dá)高于K3細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,K3-F4,K3-B6細(xì)胞的體內(nèi)外致瘤能力較K3細(xì)胞強(qiáng),并且腫瘤干性相關(guān)基因ABCG2,CD133,CD166,Bmi-1的蛋白表達(dá)也高于K3細(xì)胞。免疫熒光分析顯示K3-F

5、4,K3-B6細(xì)胞內(nèi)Vimentin的表達(dá)高于K3細(xì)胞。Westenbolt結(jié)果顯示K3-F4,K3-B6細(xì)胞中Vimentin和N-cadherin蛋白高表達(dá)。EMT促進(jìn)分子snail,slug,ZEB1,在K3-F4,K3-B6細(xì)胞中的mRNA水平也明顯高于K3細(xì)胞,而EMT負(fù)調(diào)控分子miR-200a表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：通過脾臟注射和骨髓腔注射的方法成功建立了大鼠間質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)突變腫瘤細(xì)胞株(K3)的肝臟和肺部轉(zhuǎn)移模型。