轉(zhuǎn)基因腦腫瘤模型鼠腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的比較研究.pdf

1、目的：通過(guò)Tet-on調(diào)控系統(tǒng)同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)c-myc、SV40Tag基因,建立更加穩(wěn)定的具有干細(xì)胞特性的可調(diào)控的腦腫瘤小鼠模型,對(duì)腦腫瘤干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行比較研究,旨在為腦腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究提供有意義的實(shí)驗(yàn)資料。從該模型小鼠誘導(dǎo)前后的室管膜下區(qū)及腫瘤組織中,分別分離鑒定正常神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)、誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞(NSC's)和腫瘤干細(xì)胞(brain tumorstem cells,BTSCs

2、)。通過(guò)三者的比較研究了解三者的異同點(diǎn),確定存在差異的分子機(jī)制,為腦腫瘤干細(xì)胞起源于神經(jīng)干細(xì)胞的假說(shuō)提供更多依據(jù)。
　　 方法：將pTRE2-C-myc轉(zhuǎn)基因小鼠與Tet-on、pTRE2-SV40Tag轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配,將子代中同時(shí)表達(dá)pTRE2-c-myc、Tet-on和pTRE2-SV40Tag的轉(zhuǎn)基因小鼠,進(jìn)行強(qiáng)力霉素(四環(huán)素類)誘導(dǎo),觀察腦腫瘤的發(fā)生。通過(guò)磁共振成像、大體標(biāo)本、組織切片、免疫組化對(duì)模型鼠腦腫瘤的特征進(jìn)

3、行研究。從未經(jīng)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的Tet-on轉(zhuǎn)基因成年小鼠以及誘導(dǎo)發(fā)生腦腫瘤的轉(zhuǎn)基因成體小鼠室管膜下區(qū)取材,制成單細(xì)胞懸液,培養(yǎng)于無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12,添加bFGF、EGF和B27)以及含血清分化培養(yǎng)基(DMEM+10％FCS)。從出現(xiàn)臨床癥狀的轉(zhuǎn)基因小鼠松果體區(qū)肉眼可見的腫瘤組織中取材,制成單細(xì)胞懸液,培養(yǎng)于含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基。用相差顯微鏡觀察正常神經(jīng)干細(xì)胞球體,誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞球體和腫瘤干細(xì)胞球體及其

4、分化細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞增殖情況,電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞中Hoechst33342陰性的SP(side population)細(xì)胞,細(xì)胞周期和染色體倍體。通過(guò)免疫熒光,檢測(cè)球體及其分化細(xì)胞中的nestin、NSE、GFAP、MAP2表達(dá)情況。通過(guò)免疫熒光,比較腦腫瘤干細(xì)胞和誘導(dǎo)前后神經(jīng)干細(xì)胞p53,c-myc通路的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：⑴73只同時(shí)表達(dá)pTRE2-c-myc、Tet-on和pTRE2-SV40T

5、ag的轉(zhuǎn)基因小鼠,經(jīng)過(guò)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后,30只小鼠發(fā)生腦腫瘤,發(fā)生率為41.1％。除1例腦干腫瘤外,均位于松果體區(qū),誘導(dǎo)后到發(fā)生腦腫瘤的時(shí)間最長(zhǎng)184d,最短為64d,平均為95d。腫瘤在T1加權(quán)像表現(xiàn)為等信號(hào)或稍高信號(hào),在T2加權(quán)像表現(xiàn)為等信號(hào)或稍低信號(hào),增強(qiáng)后可表現(xiàn)為均一強(qiáng)化或不均一強(qiáng)化。病理論斷為未分化成神經(jīng)管細(xì)胞瘤,腫瘤具有高侵襲性。免疫組化顯示,腫瘤高表達(dá)c-myc、SV40Tag和干/祖細(xì)胞標(biāo)志物nestin。⑵未誘導(dǎo)成體轉(zhuǎn)基

6、因小鼠和誘導(dǎo)發(fā)生腦腫瘤的成體小鼠室管膜下區(qū)細(xì)胞,在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,均呈懸浮的球狀生長(zhǎng)。未誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)球體,在含血清培養(yǎng)條件下,貼壁并分化為膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元。誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC’s)球體,則表現(xiàn)為增殖活性增加和分化抑制。電鏡可見核質(zhì)比高、細(xì)胞器不發(fā)達(dá),具干細(xì)胞特征的細(xì)胞。誘導(dǎo)后神經(jīng)干細(xì)胞與誘導(dǎo)前相比,細(xì)胞分化以及降解有關(guān)的細(xì)胞器(如溶酶體等)、自噬小體顯著減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)前后的神經(jīng)干細(xì)胞球中的SP細(xì)胞,分別

7、為10.43％、16.89％,所有細(xì)胞均為二倍體,大部分細(xì)胞位于G0/G1期。免疫熒光顯示,未誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞球體大部分細(xì)胞表達(dá)nestin,分化細(xì)胞分別表達(dá)GFAP和MAP2。誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞球體中,大部分細(xì)胞表達(dá)nestin,少部分表達(dá)分化標(biāo)志物GFAP、NSE,而部分分化細(xì)胞仍然共表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin和分化標(biāo)志物GFAP和MAP2,甚至同時(shí)表達(dá)兩種分化標(biāo)志物GFAP和MAP2。⑶腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,呈懸浮的球狀生長(zhǎng)

8、,在含血清培養(yǎng)條件下貼壁并分化為瘤性膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元。電鏡下見到核質(zhì)比高、細(xì)胞器不發(fā)達(dá)、與細(xì)胞分化降解有關(guān)的細(xì)胞器罕見。流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞球中的SP細(xì)胞為17.27％,異倍體細(xì)胞為26.77％,大部分細(xì)胞處于S期。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),細(xì)胞球中大部分細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin,少數(shù)細(xì)胞表達(dá)分化標(biāo)志物GFAP和NSE。貼壁細(xì)胞大部分仍然共表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin和分化標(biāo)志物GFAP和MAP2,甚至同時(shí)表達(dá)兩種分化標(biāo)志物GFAP和

9、MAP2。腦腫瘤干細(xì)胞和誘導(dǎo)后,神經(jīng)干細(xì)胞高表達(dá)c-myc,MDM2(p53抑制基因)。
　　 結(jié)論：①成功建立更加穩(wěn)定的、可調(diào)控的、具有干細(xì)胞特性的腦腫瘤小鼠模型,為進(jìn)一步研究腦腫瘤干細(xì)胞的特性奠定基礎(chǔ)。②成功從誘導(dǎo)前后的Tet-on轉(zhuǎn)基因成體小鼠室管膜下區(qū)中,分離到神經(jīng)干細(xì)胞,且發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的神經(jīng)干細(xì)胞表現(xiàn)為增殖活性增加和分化抑制,表明神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)早期惡性轉(zhuǎn)化表現(xiàn)。③Tet-on轉(zhuǎn)基因小鼠腦腫瘤組織中,存在具有自我更新和