磁珠分選U251細(xì)胞系中的腦腫瘤干細(xì)胞及其耐藥性的初步研究.pdf

1、1.目的： 第一部分實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用磁珠分選技術(shù)(magnetic cell sorting，MACS)分選人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U51細(xì)胞系中的CD133+和CD133-亞群細(xì)胞；比較兩個(gè)亞群細(xì)胞在增殖、分化及體內(nèi)致瘤性等方面的差異，重點(diǎn)探討CD133+細(xì)胞生物學(xué)特性；評(píng)價(jià)CD133作為腦腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的特異性與磁珠分選系統(tǒng)分選腦腫瘤干細(xì)胞的效率及特異性。 第二部分實(shí)驗(yàn)的主要目的是研究和比較CD133+細(xì)胞亞群與CD1

2、33-細(xì)胞亞群耐藥性的差異，并檢測(cè)兩個(gè)亞群細(xì)胞在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、DNA修復(fù)及抗凋亡基因等表達(dá)的差異，初步分析CD133+細(xì)胞亞群的耐藥機(jī)制。 2.方法： 第一部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)磁珠分選人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系中的CD133+和CD133-細(xì)胞亞群，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選的純度和兩個(gè)亞群細(xì)胞的細(xì)胞周期；利用MTT試驗(yàn)和單克隆形成率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩個(gè)亞群細(xì)胞的增殖能力；運(yùn)用免疫熒光檢測(cè)CD133+細(xì)胞亞群的多向分化能力以及CD1

3、33+細(xì)胞增殖形成的BTS的分化情況；最后通過(guò)裸鼠移植實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)兩個(gè)亞群細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)致瘤性的差異。第二部分實(shí)驗(yàn)在第一部分磁珠分選細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞在抗腫瘤藥物作用下形態(tài)學(xué)的變化；利用MTT試驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞亞群與CD133-細(xì)胞亞群對(duì)抗腫瘤藥物替尼泊苷、卡莫司汀和順鉑的敏感性；通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)兩個(gè)亞群細(xì)胞在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子(MDRl、BCRP、MRP)、DNA修復(fù)基因(MGMT)

4、及抗凋亡(Bcl-2)基因的表達(dá)差異。 3.結(jié)果： 第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在U251細(xì)胞系中只有大約4.5％的CD133+細(xì)胞，經(jīng)過(guò)磁珠分選后，CD133+亞群細(xì)胞的細(xì)胞純度可以提高到92.4％；分選后的CD133+細(xì)胞接種到含EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基中，具有強(qiáng)大的增殖能力，能增殖形成典型的BTS，而CD133-細(xì)胞不具有形成BTS的能力，生長(zhǎng)曲線亦顯示CD133+細(xì)胞增殖能力明顯高于CD133-細(xì)胞；流式細(xì)胞儀實(shí)

5、驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞的細(xì)胞增殖率為40.1％，CD133-細(xì)胞的細(xì)胞增殖率為30.6％；單克隆形成率實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞能形成BTS的細(xì)胞比率達(dá)到78.5％-92.4％，而CD133-細(xì)胞僅有0.8-2.4％；分化實(shí)驗(yàn)免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞能分化為具有GFAP和NeuN成熟表型的腫瘤細(xì)胞，且CD133+細(xì)胞增殖形成的BTS亦能分化為具有GFAP和NeuN成熟表型的腫瘤細(xì)胞；裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)顯示CD133+的致瘤率為71.42

6、％，而CD133-細(xì)胞沒(méi)有致瘤性。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD133-細(xì)胞在抗腫瘤藥物作用下凋亡形態(tài)學(xué)改變明顯，CD133+細(xì)胞仍能維持生長(zhǎng)；MTT實(shí)驗(yàn)顯示，CD133-細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物替尼泊苷、卡莫司汀和順鉑的敏感性明顯高于CD133+細(xì)胞；流式細(xì)胞儀試驗(yàn)顯示在中等濃度的替尼泊苷作用下，CD133-細(xì)胞的凋亡明顯，并出現(xiàn)明顯的“亞G1峰”，而CD133+細(xì)胞并未受到明顯抑制和殺滅；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD133+細(xì)胞內(nèi)的藥物蓄積明顯低于C

7、D133-細(xì)胞；RT-PCR.實(shí)驗(yàn)顯示， MDRl、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表達(dá)在CD133+明顯高于CD133-細(xì)胞。 4.結(jié)論： U251細(xì)胞系中存在少量具有增殖、多向分化與體內(nèi)致瘤能力的CD133+細(xì)胞，CD133+細(xì)胞是符合腫瘤干細(xì)胞定義的細(xì)胞亞群；磁珠分選是理想的腦腫瘤細(xì)胞分選系統(tǒng)；CD133+是U251細(xì)胞系中的耐藥細(xì)胞亞群，高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，DNA修復(fù)和抗凋亡基因可能是CD133+細(xì)胞耐藥的