通過對腫瘤細胞致瘤潛能及上皮—間充質轉化的研究探討腫瘤干細胞假說的本質.pdf

1、背景:
　　克隆演變學說是最早用于解釋實體腫瘤起始和進展生物學且被大部分學者接受的學說，它主要以遺傳變異的多樣性為理論依據(jù)，認為所有的腫瘤細胞都具有生成新的腫瘤的潛能。隨著對腫瘤研究的不斷深入，科學家提出了腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)學說，認為腫瘤干細胞是腫瘤中極小部分具有自我更新、無限增殖及分化潛能的細胞，腫瘤之所以具有無限增殖能力，其根本在于腫瘤細胞中存在占極少數(shù)量的腫瘤干細胞。目前已從人白血病、

2、乳腺癌、膠質瘤、肺癌、結直腸癌、前列腺癌，黑色素瘤及胰腺癌等14種常見腫瘤中分離、鑒定出CSCs。盡管目前大多數(shù)研究結果支持腫瘤起源于某類具有“干性”特征的腫瘤細胞，然而學術界對腫瘤干細胞學說還存在很大的爭議。Shipitsin等通過分析基因表達譜發(fā)現(xiàn)盡管乳腺癌干細胞和普通乳腺癌細胞分別是更原始和更分化的細胞群體，且它們的基因表達差異可能存在預后相關性，但是這些細胞之間的遺傳學差異支持克隆進化學說參與了腫瘤內(nèi)的異質性。而Kelly等通過

3、將小鼠來源的淋巴瘤和白血病細胞移植致組織兼容的小鼠中得出所有腫瘤細胞均具有高致瘤的結果，認為腫瘤的生長在于腫瘤細胞與其周圍微環(huán)境的適應能力而不在于細胞是否具有干細胞特征。這些爭議牽涉到傳統(tǒng)的克隆演變學說，直接沖擊了腫瘤干細胞假說的基礎—致瘤性。這一系列的爭議給腫瘤干細胞的進一步研究及對這一學說的應用前景提出新的挑戰(zhàn)，然而，這些爭議著實推動了腫瘤研究的進展。另一方面，Morel等發(fā)現(xiàn)通過EMT過程能將人永生化的人正常乳腺上皮細胞(HMLE

4、s)誘導成乳腺癌干細胞。這些研究結果為EMT在腫瘤細胞的播散及持續(xù)生長中的作用提供了充分的證據(jù)，更重要的是，它們建立了EMT與腫瘤干細胞起源之間的聯(lián)系?？傊[瘤干細胞研究至今，仍存在不少爭議;爭議的關鍵在于其是否具有特有的致瘤性，而分化的腫瘤細胞卻不再具有成瘤能力。其實，解決這一爭議的方法在于證實單個腫瘤細胞能否最終發(fā)展成腫瘤。然而，因為技術上的原因，目前仍很難準確的將單個腫瘤細胞接種于體內(nèi)模型進行研究。另一方面，如果這一學說是錯誤的

5、，那么之前的研究為什么會得出支持腫瘤干細胞存在的證據(jù)？科學家是否忽視了產(chǎn)生這些證據(jù)背后的本質呢？此外，為什么會導致EMT具有產(chǎn)生腫瘤干細胞的能力？尋找這些問題的答案可能需要對腫瘤干細胞的致瘤性及EMT在介導腫瘤干細胞惡性生物學行為中的本質進行探討。
　　目的:
　　1)通過單細胞克隆擴增-成瘤法探討不同乳腺癌細胞株中致瘤性細胞所占的比例。
　　2)探討EMT與懸浮培養(yǎng)富集乳腺癌干細胞的關系。
　　3)探討EMT在

6、腫瘤干細胞特殊生物學行為中的作用。
　　4)分析導致腫瘤干細胞具有高致瘤性的潛在的機制。
　　5)乳腺癌臨床樣本中分析腫瘤干細胞表型與間充質表型的一致性。
　　材料與方法:
　　1)CD44+/CD24-/low細胞的流式檢測及分選:將需檢測的細胞，制成單細胞懸液，以PBS調整細胞密度為每管1×106/100μl。設實驗組和同型對照組。實驗組加入CD44-FITC和CD24-PE標記的單克隆抗體，對照組加入相應的

7、同型對照抗體，4℃避光溫育，30min后加5mlPBS漂洗去除未結合的抗體，1小時內(nèi)用流式細胞儀檢測或者分選。
　　2)單細胞克隆擴增-成瘤法:將達到80％融合狀態(tài)的貼壁培養(yǎng)細胞，經(jīng)胰酶消化成單細胞狀態(tài)，按有限稀釋法，將細胞稀釋成10cells/ml，混勻后將細胞懸液接種于96孔板，200μl/孔，之后在倒置光學顯微鏡下觀察僅含1個細胞的孔并標記，接種完后將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單個細胞長成適當大小的細胞集落后，按上述消化方法將

8、孔里的細胞集落消化并將細胞懸液相應地接種于24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長至適當融合狀態(tài)后，按上述方法將細胞轉移至6孔板培養(yǎng);相似地，細胞最后擴大培養(yǎng)于10cm×10cm培養(yǎng)皿或者T75培養(yǎng)瓶中。收集由單個細胞擴增出來的細胞，制成單細胞懸液并計數(shù)，用5mlPBS洗滌兩次以去除殘留血清，再將細胞重懸于含1∶1matrigel的無血清的培養(yǎng)基中，最后細胞以1×107cells/200μl的體積皮下接種于4周齡雌性免疫缺陷BALB/c裸鼠體內(nèi);對

9、于雌激素受體陽性的細胞（包括T47D，MCF-7和BT474），受體小鼠同時在大腿肌注0.05mg17-β雌二醇，每周注射一次。每周兩次觸摸觀察腫瘤生長情況。
　　3)3D培養(yǎng)技術檢測單個腫瘤細胞的體外成瘤能力:水泥膠包埋96孔板的每一小孔，利用有限稀釋法將細胞制成10cells/ml，與含膠的培養(yǎng)液等比例混勻，100μl/孔接種于水凝膠包埋的孔里，顯微鏡下觀察只含單個細胞的孔并標記;在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。

10、　　4)乳腺癌微球體的培養(yǎng):將需要進行懸浮球培養(yǎng)的細胞重懸于不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、0.4％BSA和2％B27，以50，000cells/ml接種于六孔板（3ml/孔），在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，每隔一天加1ml新鮮培養(yǎng)基。
　　5)EMT誘導因子共培養(yǎng)乳腺癌細胞:流式細胞術分選出非腫瘤干細胞亞群重懸于分別添加有50ng/mlIL-6、20ng/mlEGF和

11、20ng/mlb-FGF、或者10ng/mlTGF-β1的相應培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　6)MTT細胞增殖檢測及阿霉素藥物敏感性檢測:
　　細胞增殖檢測:消化收集細胞，重懸于相應的培養(yǎng)基并計數(shù)，用有限稀釋法將細胞懸液稀釋成5×103cells/ml，吹打均勻后接種于96孔板，200μl/孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在相應的96孔板上設調零孔，即加200μl/孔不含細胞的相應培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)

12、12h、36h、60h、84h、108h及132h后每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
　　阿霉素藥物敏感性檢測:消化收集細胞，重懸于相應的培養(yǎng)基并計數(shù)，用有限稀釋法將細胞懸液稀釋成5×104cells/ml，吹打均勻后接種于96孔板，

13、200μl/孔，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在相應的96孔板上設調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）及對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），培養(yǎng)12h待細胞貼壁后，檢測孔每孔加10μl阿霉素工作液至終濃度為10μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。分別在加藥后4h、24h、48h、72h、96h及120h后每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，同上述方法檢測吸光值。
　　7

14、)細胞照射:采用Varian2100C直線加速器6MVX線為放射源，源皮距照射，劑量率400cGy/min，SSD=100cm，PDD=80％，照射野100mm×100mm，按0，2，4，6，8Gy的劑量分別給予照射。
　　8)克隆形成實驗及放射生物學參數(shù)及劑量存活曲線的擬合:將照射后的細胞置于37℃，5％CO2的孵育箱進行培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)15-25天。終止培養(yǎng)后常規(guī)以PBS緩沖液洗滌細胞2次，去除培養(yǎng)液中的蛋白成分，每孔加入1.5

15、ml100％甲醇，室溫固定15分鐘;PBS清洗兩次，每孔加入1ml1％的結晶紫染色后，室溫作用20分鐘;流水緩慢洗去多余染液，晾干，在顯微鏡下計算細胞＞50個的細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率（克隆形成率=生成的克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100％）和存活分數(shù)（survival fraction，SF=受照射細胞的克隆形成率/對照組細胞克隆形成率×100％）。最后，對所得的存活分數(shù)的平均數(shù)進行分析，運用Graph Pad Prism 5.0軟件進行單

16、擊多靶模型曲線擬合，并根據(jù)單擊多靶模型求出D0、Dq及N，其中l(wèi)ogN=Dq/D0。
　　9)細胞遷移能力檢測:收集細胞，用5mlPBS洗滌3次，充分去除殘留的血清，離心后將細胞重懸于含0.1％BSA的培養(yǎng)基（不含血清及細胞因子）中并計數(shù)，調整細胞密度為5×105cells/ml，吹打混勻后吸200μl細胞懸液接種于transwell上室，并在下室加入500μl完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后取出小

17、室置于24孔板，加適量的PBS泡洗5次，然后用0.4％多聚甲醛固定20分鐘，再用PBS泡洗2次，其后加適量的1％的結晶紫染色20分鐘，最后用PBS洗滌去除未染的結晶紫并用棉簽輕輕擦去上層未穿透的細胞，光學顯微鏡下觀察并拍照，選擇隨機的5個視野計算小室底面的細胞。
　　10)制備慢病毒載體穩(wěn)定過表達miR-200c:以人基因組DNA為模板PCR擴增目的基因;表達載體酶切后回收線性化的載體片段;目的基因片段與線性化的載體片段經(jīng)同源重組

18、后轉化E.coli感受態(tài)細胞;用菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送測序;測序無誤的克隆進行質粒抽提;采用脂質體法將慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質粒按比例共轉染293細胞，收集上清液，離心過濾后，得到慢病毒懸液。病毒滴度采用qPCR實驗進行測定。將慢病毒和空病毒載體感染乳腺癌細胞。采用流式細胞儀分選出GFP(+)細胞進行擴大培養(yǎng)。Real time qPCR檢測miR-200c表達水平。
　　11)Real time RT-PCR檢測基因的表

19、達水平:收集細胞，提取RNA，逆轉錄成cDNA，基于ABI Prism 7500系列檢測系統(tǒng)，使用ToYoBo公司的SYBR Green試劑盒進行實時熒光定量PCR。
　　12)Western blotting檢測細胞中E-cadherin，Vimentin，CD44及CD24蛋白的表達。
　　13)細胞免疫熒光技術檢測細胞中E-cadherin，Vimentin，CD44及CD24蛋白的表達。
　　14)免疫組化檢測

20、組織樣本中E-cadherin，Vimentin，F(xiàn)ibronectin，CD44及CD24分子的表達。
　　15)統(tǒng)計方法:實驗結果應用SPSS13.0軟件，以兩個或多個獨立樣本率比較的x2檢驗、單向方差分析（One-Way ANOVA）及Bonferroni多重比較方法進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1)致瘤性細胞普遍地存在于乳腺癌細胞株中不管是CSCs群體還是non-CSCs群體，

21、均呈現(xiàn)出高比例的克隆性細胞，形成的細胞克隆可以經(jīng)不斷擴大培養(yǎng)獲得大量的腫瘤細胞。當達到1×107數(shù)量級時，將細胞重懸于含1∶1Matrigel的無血清培養(yǎng)基并接種于免疫缺陷的BALB/c裸鼠體內(nèi)。經(jīng)這種克隆擴增法獲得的細胞，不管它們來源于CSCs群體還是non-CSCs群體，均能在裸鼠體內(nèi)形成肉眼可見的腫瘤。而對于永生化的正常人乳腺上皮細胞僅含少量的克隆性細胞，而且這些細胞擴增出來的細胞群體不能在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)形成任何腫瘤。

22、　　2)懸浮培養(yǎng)富集腫瘤干細胞與細胞的上皮-間充質轉化有關分選出來的非乳腺癌干細胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)后同樣能富集具有干細胞標記的細胞群體;懸浮培養(yǎng)獲得的細胞具有EMT相關的基因表達模式;在高粘附培養(yǎng)板或者添加血清后細胞貼壁生長，細胞形態(tài)呈現(xiàn)間充質樣外觀;細胞免疫熒光及Western blot檢測顯示上皮標記E-cadherin表達下調，而間充質標記Vimentin的表達上調。
　　3)“腫瘤干細胞”是一群具有間充質表型的細胞亞群分選出來的

23、非腫瘤干細胞在含有不同的EMT誘導因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后出現(xiàn)細胞形態(tài)由鵝卵石樣向梭形或者星形樣轉變，這種現(xiàn)象在luminal型乳腺癌細胞中尤為明顯。誘導培養(yǎng)10天后，在luminal型細胞中顯著富集了CD44+細胞（在MCF7細胞中還顯著富集了CD44+/CD24-/low細胞），在Basal型細胞株中顯著富集了CD24-細胞，在CD44+的MCF-10A細胞中同樣顯著富集了CD24-細胞，這些細胞誘導產(chǎn)生CD44+或者CD24-

24、細胞的結果與懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生具有這些表型的細胞的結果一致。進一步檢測發(fā)現(xiàn)這些誘導產(chǎn)生的CD44+或者CD24-細胞呈現(xiàn)出與EMT相關的基因表達模式及蛋白表達模式。
　　4)EMT并不賦予腫瘤細胞致瘤性而只是賦予腫瘤細胞其它惡性特征利用克隆擴增-成瘤法檢測了經(jīng)不同細胞因子誘導后產(chǎn)生的CD44+或者CD24-細胞的致瘤潛能。發(fā)現(xiàn)經(jīng)EMT誘導后產(chǎn)生的這些細胞并沒有表現(xiàn)出更高的克隆及成瘤能力。進一步檢測這些細胞的其它生物學功能，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL6和

25、EGF+bFGF誘導產(chǎn)生的CD44+或CD24-細胞均具有顯著增高的細胞增殖能力、阿霉素抵抗、輻射抵抗及侵襲能力。
　　5)細胞增殖能力的差異可能是導致CSCs的發(fā)現(xiàn)的主要原因當用含生長因子（40ng/mlEGF和40ng/mlbFGF）的基質膠重懸non-CSCs后接種于NOD/SCID小鼠體內(nèi)時，non-CSCs能在相同的時間內(nèi)形成更多的腫瘤，形成的腫瘤數(shù)甚至多于CSCs在相同時間里所形成的腫瘤數(shù)。
　　6)腫瘤細胞致瘤

26、性并不依賴于間充質特性間充質型乳腺癌細胞株穩(wěn)定表達miR-200c后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的MET樣改變，即從梭形的間充質形態(tài)向鵝卵石樣上皮形態(tài)轉化。定量RT-PCR結果顯示基因呈現(xiàn)MET相關表達模式，即上皮表型相關基因E-cadherin表達上調，而間充質表型相關的基因(Vimentin、N-cadherin和Fibronectin)表達下調;干細胞相關的標記CD44基因表達也明顯下調。流式檢測顯示穩(wěn)定表達miR-200c組細胞具有干細胞

27、標記的細胞比例顯著減少，而非干細胞比例顯著升高。Western blot同樣證實了上皮標記的上調，間充質標記的表達的抑制，同時伴隨明顯的CD44表達抑制。發(fā)生MET后明顯減慢了細胞的生長速度，增加了細胞對阿霉素的藥物敏感性及對輻射的敏感性，同時細胞的侵襲能力明顯受抑制。然而MET后并沒有影響克隆性及致瘤性細胞的比例。
　　7)乳腺癌臨床樣本中干細胞表型與間充質表型高度一致腫瘤干細胞陽性的樣本中上皮型標記E-cadherin表達的陽

28、性率為34.4％(11/32)，而在非腫瘤干細胞樣本組中E-cadherin表達的陽性率為75.0％(39/52)，兩組樣本中E-cadherin表達的陽性率有顯著統(tǒng)計學差異(x2=13.570，P=0.000);另一方面，間充質標記Vimentin表達在腫瘤干細胞組的陽性率為71.9％(23/32);而其在非腫瘤干細胞組的表達陽性率僅為21.2％(11/52)，兩組中Vimentin的表達的陽性率同樣有顯著的統(tǒng)計學差異（x2=21.1

29、53，P=0.000）。我們還進一步研究了典型的間充質表型E-cadherin-/Vimentin+(甚至E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+)在兩組樣本中的比例，發(fā)現(xiàn)這些表型在兩組樣本中的比例存在顯著的統(tǒng)計學差異（E-cadherin-/Vimentin+∶x2=17.376,P=0.000;E-cadherin-/Vimentin+/Fibronectin+∶x2=14.114,P=0.000)。因此

30、，在臨床腫瘤樣本中證實表達乳腺癌干細胞標記的樣本同時表達間充質標記，從而支持了我們關于腫瘤干細胞是一群具有間充質樣特性的細胞群體的結果。
　　結論:
　　1.致瘤性細胞普遍地存在于乳腺癌細胞中;
　　2.懸浮培養(yǎng)富集腫瘤干細胞與細胞經(jīng)歷EMT有關;
　　3.腫瘤干細胞是一群具有間充質表型的細胞亞群;EMT并不賦予腫瘤細胞致瘤性而只是賦予腫瘤細胞其它惡性特征，即腫瘤細胞的致瘤性并不依賴于間充質特性;細胞增殖能力的差