microRNA在胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞中的表達譜研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 懸浮培養(yǎng)法分離人胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞
　　目的:探討懸浮培養(yǎng)法在胃癌細胞株MKN-45中分離胃癌干細胞的可行性,為研究胃癌干細胞建立一種細胞模型。
　　方法:人胃癌細胞株MKN45購自中科院上海細胞庫。MKN45細胞復(fù)蘇以后在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),細胞貼壁以后,收集貼壁細胞置于含無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板

2、(Corning)中培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入1％N-2添加劑,2％B-27添加劑(Invitrogen),1％青鏈霉素(Gibco),20ng/ml人FGF-2和100ng/mlEGF(Chemicon),觀察的腫瘤球形成情況,每孔100個細胞,兩周后在倒置顯微鏡(Olympus)下放大40及100倍觀察腫瘤球形成情況。當形成的克隆球長到200-500個細胞時,將腫瘤球溶解成1000個/ml細胞的溶液,按每孔100μL單細胞懸液植入含無血清培

3、養(yǎng)液的96孔的超低粘附板(Corning)中,兩周后觀察第二代腫瘤球就形成情況,貼壁細胞作為對照組觀察成球情況。重復(fù)上述步驟,亞代球體細胞體外傳代培養(yǎng)六代以上。
　　結(jié)果:胃癌MKN-45細胞在無血清培養(yǎng)基中能形成懸浮球狀體。懸浮培養(yǎng)7d即開始形成細胞球體,培養(yǎng)至14d球體基本形成,中心密度増高。培養(yǎng)21d左右球體完全形成,球體結(jié)構(gòu)飽滿,細胞排列致密,中心密度更高。第一代球體細胞吹散后在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),能繼續(xù)形成細胞球體,

4、隨著傳代代數(shù)的增加,成球率逐漸增高,傳代至第六代時,成球率達29.70％±6.21％,而原代細胞的成球率為3.30％±1.49％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:采用懸浮培養(yǎng)法在胃癌細胞株MKN-45中分離出的懸浮球體細胞具有自我更新與增殖的CSC的特性。
　　第二部分 人胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞的鑒定
　　目的:鑒定懸浮培養(yǎng)法分離的懸浮球體細胞的腫瘤干細胞的特性,為進一步研究胃癌干細胞建立一種實

5、用而有效的細胞模型。
　　方法:①實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測干性基因Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在球體細胞與貼壁細胞中的表達;②免疫熒光檢測干細胞標志物 Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45懸浮球體細胞及貼壁細胞中的表達;③免疫印跡分析測定干細胞標志物Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45懸浮球體細胞的中的表達;④化療耐受實驗:提取培養(yǎng)至14天的MKN-45球體細胞接

6、種于96超孔板低粘附板中,每孔2×103/200ul;取MKN-45貼壁細胞,接種于普通的96孔板中,每孔2×103/200ul。分別在球體細胞及貼壁細胞加入傳統(tǒng)化療藥5-Fu及DDP檢測,PBS作為內(nèi)參。藥物濃度及作用方式為單藥5-Fu(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml),單藥 DDP(10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml),5-Fu聯(lián)合DDP(50μg/ml+10μg/ml;100μg/m+20μg/ml

7、;200μg/ml+40μg/m),化療藥作用24及48小時后,分別加入MTT37?C孵化4h,更換150mlDMSO。細胞存活數(shù)根據(jù)OD450nm(Abs)吸光值評估。;⑤選用雄性無胸腺裸鼠6-8周年齡24只,分別提取培養(yǎng)至14天MKN-45懸浮球體細胞數(shù)1x104,2x104,2x105,2x106個,提取相應(yīng)數(shù)量的貼壁細胞作為對照。球體細胞注射在右前背部皮下,原代貼壁細胞注射在左前背部皮下,每7-10天觀察腫瘤形成情況,直至8周處

8、死,腫瘤標本固定在10％福爾馬林液中,作H&E病理檢查。
　　結(jié)果:①實時定量PCR與免疫印跡實驗顯示,球體細胞Oct-4,Sox2,Nanog和CD44的相對表達量分別為2.92±0.44、4.49±0.20、2.34±0.22、1.18±0.04;原代貼壁細胞Oct-4,Sox2,Nanog和 CD44的相對表達量分別為1.02±0,06、1.00±0.06、1.00±0.00、1.00±0.05,球體細胞Oct-4,Sox2

9、,Nanog和CD44明顯高于原代貼壁細胞(P<0.05)②免疫熒光顯示Oct-4,Sox2以及 Nanog蛋白主要在細胞核周圍及細胞質(zhì)中陽性表達,而CD44主要在細胞膜上表達。Oct-4/CD44,Sox2/CD44以及Nanog/CD44雙重染色提示胚胎蛋白Oct-4、Sox2以及Nanog均與CD44在同一球體細胞中表達;③5-Fu及DDP作用24小時后,球體細胞呈現(xiàn)明顯的藥物抵抗能力,球體細胞的存活率明顯高于原代貼壁細胞,其中,

10、50μg/ml,100μg/ml及200μg/ml5-Fu作用后,球體細胞的存活率分別為原代貼壁細胞的1.3倍,1.4倍和1.7倍,10μg/ml,20μg/ml及40μg/ml DDP作用后,球體細胞的存活率分別為原代貼壁細胞的1.7倍,3.2倍和3.4倍。作用48小時,無論是5-Fu還是DDP,球體細胞存活率無明顯增高,但當5-Fu聯(lián)合DDP作用24小時后,球體細胞存活率分別為原代貼壁細胞的2.6,2.9以及2.7倍,作用48小時后

11、球體細胞存活率分別為原代貼壁細胞的5.1倍,4.8倍以及5.4倍。④MKN-45球體細胞2x104個細胞即能形成移植瘤,而原代貼壁細胞需要2x106個細胞才能形成移植瘤,球體細胞致瘤能力是原代貼壁細胞的100倍。且球體細胞形成的腫瘤比原代貼壁細胞形成的瘤體大。H&E檢查顯示球體細胞形成的腫瘤與原代貼壁細胞形成的瘤體的病理改變表現(xiàn)相似,主要是已分化的胃癌細胞。
　　結(jié)論:懸浮培養(yǎng)法分離的懸浮球體細胞具有的腫瘤干細胞的特性,這些特性包

12、括自我更新與增殖能力、對傳統(tǒng)化療藥物的耐受性、高致瘤能力、干性基因與蛋白的高表達等。該方法為胃癌干細胞的進一步研究提供了一種實用而有效的細胞模型。另外,Oct4/CD44、Sox2/CD44、Nanog/CD44可能分別是胃癌CSC的一種表型。
　　第三部分 microRNA在人胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞中的表達譜
　　目的:探討microRNA在胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞中的表達譜,預(yù)測miRNA的靶基因,并分

13、析其在胃癌干細胞中的生物學(xué)功能。
　　方法:①采用懸浮培養(yǎng)法分離出球體細胞(胃癌干細胞);②基因芯片(Agilent’shuman miRNA microarray,version18.0)測定球體細胞(胃癌干細胞)與貼壁細胞間的miRNA的特性表達譜;③RT-PCR驗證miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-16-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p,let-7b-3p,miR-34a

14、-5p,miR-4270,和miR-483-5p這10個miRNA的表達,所有驗證均重復(fù)三次。④通過MiRanda, TargetScan以及Pictar三個在線數(shù)據(jù)庫對上述10個miRNA作生物信息學(xué)分析,預(yù)測miRNA的靶基因,并分析其在胃癌干細胞中的生物學(xué)功能。這三個在線數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址分別是:miRanda:http://microrna.sanger.ac.uk;TargetScan:http://www.targetscan.o

15、rg。PicTar: http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link-Database/mirna_target_database,
　　結(jié)果:①microRNA芯片檢測結(jié)果顯示,懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)胃癌細胞株MKN-45所形成的懸浮球體細胞與原代貼壁細胞之間有1887個microRNA的表達存在程度不等的差異,其中差異在兩倍以上的microRNA有182個,絕大多數(shù)(173個)microRNA在球體細胞

16、中表達下調(diào),少部分(9個)表達上調(diào)。②qRT-PCR驗證結(jié)果顯示,10個microRNA在球體細胞與原代貼壁細胞間的相對表達量存在明顯差異,其中,7個microRNA(miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p,miR-4270以及miR-483-5p)的表達水平與芯片檢測結(jié)果一致,3個microRNA(miR-16-5p,,let-7b-3p,miR-34a-5p)的表達

17、水平與芯片檢測結(jié)果不一致,符合率70％③MiRanda,TargetScan以及Pictar三個在線數(shù)據(jù)庫的交集中,有384對miRNA:mRNA配對靶點,其中miR-181a-5p,miR-27a-3p,miR-34a-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-4270,let-7b-3p,以及miR-29a-3p可以預(yù)測到靶基因,而miR-483-5p與 miR-16-5p未能預(yù)測到靶基因。④我們采用CytoScapeR

18、軟件對miRNA–mRNA靶基因之間的相互作用的網(wǎng)絡(luò)作了分析,結(jié)果顯示,每一個miRNA可以有數(shù)十個乃至上百個靶基因,許多靶基因可以是多個miRNA的潛在靶基因,即多個miRNA可以調(diào)控同一個靶基因,這些靶基因中的絕大多數(shù)與肌動蛋白骨架、粘著斑、胞外基質(zhì)受體的交互作用以及腫瘤的信號通路有關(guān)。特別是許多靶基因與干細胞相關(guān)的一些重要的信號通路有關(guān),這些信號通路包括Notch、Wnt/β-catenin、MAPK、mTOR以及JAK-STAT