hTERT在干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：1.采用RQ-TRAP和 TRAP-ELISA法檢測(cè)不同細(xì)胞端粒酶活性，證實(shí) RQ-TRAP法的優(yōu)越性,
　　2.研究比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞端粒長度的差異，探討干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中端粒的調(diào)節(jié)機(jī)制,
　　3.研究比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的差異和hTERT基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。
　　方法：1.采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA兩種方法同時(shí)檢測(cè)12（9個(gè)腫瘤細(xì)胞系和3個(gè)

2、正常細(xì)胞系）種細(xì)胞的端粒酶活性，并比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果,2.利用無血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)富集球狀生長的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(sphere forming cells-SFCs)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞比例的變化，用RT-PCR方法檢測(cè)、比較細(xì)胞的干性和分化標(biāo)記物 Oct-4、SOX-2、CK-18的表達(dá)狀態(tài),3.采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Q-PCR）的方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的端粒長度4

3、.采用TRAP-ELISA方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性5.以普通的RT-PCR方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞hTERT基因的mRNA的表達(dá)水平、以Western blot方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1. RQ-TRAP方法能準(zhǔn)確特異地檢測(cè)系列稀釋的293T細(xì)胞蛋白提取液的端粒酶活性，靈敏度可達(dá)8個(gè)細(xì)胞，擴(kuò)增效率為99％。陰性對(duì)照組則未檢測(cè)到端粒酶活性。RQ-TRAP方法測(cè)得12個(gè)

4、細(xì)胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA方法結(jié)果有相關(guān)性（R2=0.7625）,
　　2.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示無血清懸浮培養(yǎng)獲得較高比例的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，并且比普通腫瘤細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、SOX-2，低表達(dá)分化因子 CK-18（P＜0.05）,
　　3.通過 Q-PCR方法檢測(cè)結(jié)果分析，人乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞（MCF7-SFCs）端粒長度（1.201±0.05212）長于人乳腺癌 MCF7細(xì)胞（1.0

5、19±0.1005），人宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞（HeLa-SFCs）的端粒長度（1.602±0.1355）長于人宮頸癌 Hela細(xì)胞(1.024±0.0977)，經(jīng) t檢驗(yàn)分析p＞0.05，乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間端粒長度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,
　　4.采用TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性結(jié)果顯示：人乳腺癌 MCF7細(xì)胞系、人宮頸癌 Hela細(xì)胞系、人乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞（MCF7-SFCs）

6、和人宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞（HeLa-SFCs）端粒酶活性均陽性。干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的相對(duì)端粒酶活性（RTA）明顯低于普通腫瘤細(xì)胞，經(jīng) t檢驗(yàn)分析p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞（MCF7-SFCs和 Hela-SFCs細(xì)胞）hTERT mRNA表達(dá)低于普通腫瘤細(xì)胞（MCF7細(xì)胞和Hela細(xì)胞），經(jīng)t檢驗(yàn)分析P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的hTERT基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平均低于普通腫瘤細(xì)胞表達(dá)