mTOR在鼻咽癌細(xì)胞系CNE2腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　檢測鼻咽癌細(xì)胞系CNE2腫瘤干細(xì)胞中mTOR的表達(dá)情況，探索雷帕霉素通過調(diào)控鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞mTOR信號通路來抑制其增殖的作用。
　　方法:
　　1.通過無血清懸浮培養(yǎng)法來富集鼻咽癌細(xì)胞系CNE2腫瘤球細(xì)胞，用CCK8法檢測成球細(xì)胞及CNE2細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中不同時(shí)間（第1、3、5、7天）的增殖活性。
　　2.利用Western blot法檢測鼻咽癌腫瘤球細(xì)胞及CNE2細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白CD44

2、、OCT4、SOX2和mTOR及其下游相關(guān)蛋白P70S6、4EBP1的表達(dá)。
　　3.CCK8法檢測不同濃度雷帕霉素(0、0.1、1、10、100、1000nmol/L)作用鼻咽癌腫瘤球細(xì)胞及CNE2細(xì)胞48小時(shí)后的細(xì)胞抑制率，計(jì)算各自半數(shù)有效濃度(EC50)。
　　4.不同濃度的雷帕霉素(0、20、50、100 nmol/L)作用鼻咽癌腫瘤球細(xì)胞48小時(shí)后，利用Western blot檢測mTOR及其信號通路下游相關(guān)蛋白P

3、70S6、4EBP1的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法:采用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件處理分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組樣本均數(shù)之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，多組樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析方法，多組樣本間進(jìn)一步多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)方法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.成球細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中增殖較CNE2細(xì)胞明顯，與CNE2相比，成球細(xì)胞OCT4、SOX2呈過

4、度表達(dá)(OCT4:t=2.577 P=0.042＜0.05; SOX2: t=8.490P=0.000＜0.05)，而在CD44的表達(dá)上，兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.456 P=0.196＞0.05)。
　　2.在mTOR、P70S6、4EBP1的表達(dá)上，兩組細(xì)胞間無明顯差異(mTOR:t=0.333P=0.751＞0.05;4EBP1: t=0.218 P=0.835＞0.05; P70S6: t=0.812P=0.448

5、＞0.05)，而在各自磷酸化形式(P-mTOR、P-P70S6、P-4EBP1)的表達(dá)上，成球細(xì)胞較CNE2明顯呈過表達(dá)狀況(P-mTOR: t=4.022 P=0.007＜0.05;P-4EBP1: t=8.243 P=0.000＜0.05; P-P70S6:t=7.969 P=0.000＜0.05)。
　　3.不同濃度雷帕霉素作用鼻咽癌成球細(xì)胞及CNE2細(xì)胞48小時(shí)后，對比兩者半數(shù)有效濃度(EC50)，成球細(xì)胞為27.59nM

6、，CNE2細(xì)胞為78.12nM，雷帕霉素對成球細(xì)胞具有更強(qiáng)抑制作用。
　　4.不同濃度雷帕霉素作用成球細(xì)胞48小時(shí)后，在P-mTOR、P-P70S6、P-4EBP1的表達(dá)上隨濃度的升高而呈逐漸下降趨勢，而在mTOR、P70S6、4EBP1表達(dá)上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.通過無血清懸浮培養(yǎng)法富集起來的鼻咽癌細(xì)胞系CNE2腫瘤球細(xì)胞，具有類腫瘤干細(xì)胞特性。
　　2.鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞中mTOR信號通路相

7、關(guān)蛋白呈過度表達(dá)。
　　3.相對鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，雷帕霉素對鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性
　　4.雷帕霉素可通過下調(diào)mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞增殖活性。
　　5.據(jù)此推斷:鼻咽癌細(xì)胞系CNE2腫瘤干細(xì)胞中mTOR信號通路蛋白呈過度表達(dá)狀態(tài)，而雷帕霉素可通過調(diào)控mTOR信號通路來抑制其增殖活性，針對腫瘤干細(xì)胞mTOR信號通路靶向治療，雷帕霉素有望為治療鼻咽癌提