ABT-737與雷公藤紅素聯(lián)合抗腫瘤活性的機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討和研究雷公藤紅素(Celastrol)和ABT-737聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402和HepG2凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　 方法:1.MTT法檢測ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)單用及合用人肝癌細(xì)胞Bel-7402和HepG2的細(xì)胞存活率,并采用軟件CalcuSyn計(jì)算CI值;2.DAPI染色觀察ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后,細(xì)胞凋亡小體的產(chǎn)生;3.PI染色結(jié)合流式細(xì)

2、胞術(shù)檢測ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后細(xì)胞凋亡率的變化;4.JC1染色觀察ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后,線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential,△ψm)的變化;5.Westemblotting法檢測ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后,凋亡相關(guān)蛋白,Hsp90客戶蛋白,NOXA等關(guān)鍵蛋白的含量變化;6.real-timeRT-PCR法

3、檢測雷公藤紅素(Celastrol)作用后,細(xì)胞NOXA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化;7.小分子RNA干擾技術(shù)敲除ATF4,觀察雷公藤紅素(Celastrol)作用后,細(xì)胞NOXA基因轉(zhuǎn)錄水平的變化;8.小分子RNA干擾技術(shù)敲除NOXA,觀察ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后,細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活率的變化;9.免疫共沉淀法觀察ABT-737和雷公藤紅素(Celastrol)作用后,NOXA蛋白與Mcl-1蛋白的結(jié)合情況。

4、　　 結(jié)果:1.ABT-737和雷公藤紅素不同濃度均具有協(xié)同抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402和HepG2生長的作用,合用CI值均小于0.7,具有協(xié)同作用;DAPI染色結(jié)果顯示,Bel-7402和HepG2細(xì)胞給藥72h以后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素單用組與對(duì)照組相比無明顯凋亡小體的產(chǎn)生,而合用組細(xì)胞染色質(zhì)發(fā)生聚縮、并形成凋亡小體;3.PI單染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率的結(jié)果顯示,Bel-7402和HepG2細(xì)胞給藥2

5、4h、48h、72h后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素合用組與兩藥單用組相比較,細(xì)胞凋亡率均有顯著性差異,呈時(shí)間依賴性關(guān)系增加;2.JC-1染色觀察細(xì)胞線粒體膜電位變化,Bel-7402和HepG2細(xì)胞給藥24h后,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素單用組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比未呈現(xiàn)明顯綠色熒光,兩藥合用組可使細(xì)胞呈現(xiàn)大量綠色熒光(即△ψm降低);Bel-7402和HepG2細(xì)胞給藥6、12、24h后,ABT-

6、737和雷公藤紅素合用組可使細(xì)胞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的線粒體膜電位降低;提取胞漿蛋白檢測細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素合用,與單用組相比,能夠明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì);westernblotting結(jié)果顯示,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素合用,與單用組相比,能夠明顯促進(jìn)Bel-7402和HepG2細(xì)胞內(nèi)caspase-3的斷裂和PARP的裂解;3.we

7、sternblotting結(jié)果顯示,1.25、2.5、5μM雷公藤紅素能夠誘導(dǎo)Bel-7402和HepG2細(xì)胞內(nèi)ub上調(diào),HSP90客戶蛋白p-ERK,CDK4降解,HSP70蛋白累積,具有HSP抑制活性;westernblotting和RT-PCR結(jié)果顯示,1.25、2.5、5μM雷公藤紅素能夠弓I發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)p-elF2a和ATF4上調(diào),并且上調(diào)NOXAmRNA表達(dá);小分子RNA干擾技術(shù),westernbl

8、otting和RT-PCR結(jié)果顯示,HepG2細(xì)胞敲除ATF4基因以后,與未敲除的細(xì)胞相比,雷公藤紅素上調(diào)NOXAmRNA表達(dá)的作用明顯減弱;4.Westernblotting結(jié)果顯示,1.25μM雷公藤紅素單用,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素共同作用,均能夠誘導(dǎo)Bel-7402和HepG2細(xì)胞內(nèi)NOXA上調(diào),且該上調(diào)作用的發(fā)生早于細(xì)胞凋亡;小分子RNA干擾技術(shù)、westernblotting和MTT結(jié)果顯示,HepG2

9、細(xì)胞敲除NOXA基因以后,與未敲除的細(xì)胞相比,雷公藤紅素和ABT-737誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生caspase-3斷裂和PARP裂解的作用明顯減弱,對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用也被取消;5.免疫共沉淀法結(jié)果顯示,1.25μM雷公藤紅素單用,10μMABT-737和1.25μM雷公藤紅素共同作用,均能夠促進(jìn)NOXA與Mcl-1的蛋白結(jié)合。
　　 結(jié)論:ABT-737和雷公藤紅素能夠協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線粒體通路的細(xì)胞凋亡,其具體機(jī)制為雷公藤紅素通過其