基于E-cadherin調(diào)控的雷公藤紅素抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：天然來(lái)源的雷公藤紅素對(duì)NF-κB具有顯著的抑制作用，并且表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，但明顯的毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。HDAC抑制劑SAHA已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，但其單藥治療實(shí)體瘤的療效不佳，主要原因與其激活NF-κB通路相關(guān)。
　　方法：⑴通過(guò)SRB法測(cè)定細(xì)胞存活率、克隆形成實(shí)驗(yàn)、凋亡的檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥的體外抗腫瘤活性；Western blot和雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)考察NF-κB活性；建立對(duì)SAHA耐藥的SK-OV-3細(xì)胞株

2、；siRNA技術(shù)/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)E-cadherin基因進(jìn)行特異性沉默/高表達(dá)，考察E-cadherin對(duì)雷公藤紅素的抗腫瘤活性的影響；建立人肺癌細(xì)胞95-D的裸鼠異種移植瘤模型，考察雷公藤紅素和SAHA的體內(nèi)抗腫瘤協(xié)同作用。⑵Western blot分析雷公藤紅素對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)水平的影響；siRNA對(duì)p38特異性沉默，考察p38對(duì)雷公藤紅素調(diào)控E-cadherin作用的影響；以TGF-β誘導(dǎo)EMT模型，觀察細(xì)胞形態(tài)變化

3、，采用Western blot分析雷公藤紅素對(duì)上皮/間質(zhì)標(biāo)記物蛋白水平的影響，考察雷公藤紅素對(duì)EMT的影響；采用Western blot、RT-PCR及雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)Snail、Slug的蛋白/轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平以及Smad信號(hào)通路的影響；采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)及Transwell法分別評(píng)價(jià)雷公藤紅素對(duì)細(xì)胞粘附、遷移及侵襲能力的影響；采用B16-F10-GFP細(xì)胞C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型，檢測(cè)雷公藤紅素的

4、體內(nèi)抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性；采用SRB法、PI染色法、Western blot法檢測(cè)雷公藤紅素與EGFR抑制劑的合用效果。
　　結(jié)果：①雷公藤紅素和SAHA在多種腫瘤細(xì)胞上均表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同抑制細(xì)胞增殖作用，同時(shí)兩藥合用能夠顯著增加Caspase介導(dǎo)的凋亡發(fā)生。雷公藤紅素與SAHA合用能夠顯著抑制NF-κB活性，進(jìn)而增強(qiáng)SAHA的抗腫瘤活性。然而雷公藤紅素與SAHA的合用效果優(yōu)于特異性NF-κB抑制劑與SAHA的合用效果，提示還有其他因素

5、參與了兩藥合用的協(xié)同抗腫瘤作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的抗腫瘤活性受到細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)的影響，而雷公藤紅素與SAHA聯(lián)合用藥能上調(diào)E-cadherin表達(dá)，這很可能是兩藥協(xié)同作用的另一機(jī)制。兩藥通過(guò)交互增敏的方式發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。在此基礎(chǔ)上，在人肺癌細(xì)胞95-D的裸小鼠移植瘤模型上，雷公藤紅素與SAHA合用能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并且沒(méi)有引起明顯的毒副作用。②雷公藤紅素能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表

6、達(dá)，而這一調(diào)控作用依賴于它激活p38的作用。在TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)模型中，雷公藤紅素能夠抑制Smad信號(hào)通路，下調(diào)Slug/Snail的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin并干擾間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生。雷公藤紅素能夠通過(guò)靶向β1整合素通路抑制Fibronectin(FN)介導(dǎo)的細(xì)胞-ECM粘附，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移及侵襲能力，而p38的激活參與其中。在體內(nèi)模型中，雷公藤紅素能夠顯著抑制

7、B16-F10-GFP細(xì)胞形成肺轉(zhuǎn)移。此外，EGFR抑制劑的抗腫瘤活性與細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)相關(guān)，而雷公藤紅素上調(diào)E-cadherin的作用使其能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的敏感性。
　　結(jié)論：⑴雷公藤紅素與SAHA在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗腫瘤活性，能夠協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。雷公藤紅素能夠抑制NF-κB活性，以克服腫瘤細(xì)胞對(duì)SAHA的耐藥，同時(shí)SAHA能夠通過(guò)上調(diào)E-cadherin表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)雷公藤紅