癌蛋白p28Gank的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝癌的發(fā)生與多種病原引起的慢性肝炎密切相關(guān)。慢性炎癥微環(huán)境中的炎性因子如TNFα，IL-1β，IL6等在促癌過程起到重要作用。IL-1β是NF-κB信號(hào)通路及其他信號(hào)通路的強(qiáng)效促炎性因子，NF-κB信號(hào)通路在癌前細(xì)胞或炎性細(xì)胞內(nèi)的激活被認(rèn)為是慢性肝炎與肝癌之間的根本聯(lián)系。IL-1β發(fā)揮生物學(xué)功能主要是同跨膜受體IL-1RI結(jié)合后，IL-1RI招募MyD88。MyD88再招募IL-1受體相關(guān)激酶IRAK4

2、和IRAK1；IRAK4磷酸化IRAK1，并將IRAK1釋放入胞質(zhì)中，從而IRAK1同TRAF6等形成復(fù)合物，激活NF-κB或Jun信號(hào)通路。
　　 p28Gank(也被稱為p28、Gankyrin、PSMD10)是2000年首次在肝癌中發(fā)現(xiàn)的癌蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明HCC中高表達(dá)p28Gank是不良預(yù)后和短生存期的預(yù)測(cè)因子，可以使癌細(xì)胞發(fā)生EMT。過表達(dá)p28Gank可誘導(dǎo)細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力提高。p28G

3、ank可以結(jié)合Rb促進(jìn)其磷酸化和降解；還可以同MDM2結(jié)合，促進(jìn)p53的泛素化降解；p28Gank可激活A(yù)KT/PI3K/HIF1α途徑促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。
　　 作為癌基因，p28Gank至今未發(fā)現(xiàn)有突變。P28Gank驅(qū)動(dòng)的腫瘤發(fā)生基本是由HCC中p28Gank異常高表達(dá)引起的。研究p28Gank的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解肝癌發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 1.生物信息學(xué)方法分析p28Gank啟動(dòng)予區(qū)

4、并構(gòu)建p28GANK報(bào)告基因質(zhì)粒及缺失突變質(zhì)粒；
　　 2.運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選對(duì)p28Gank轉(zhuǎn)錄活性有影響的藥物。采用熒光定量PCR和WesternBlot對(duì)藥物作用加以驗(yàn)證。
　　 3.采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)研究p28Gank啟動(dòng)子結(jié)合蛋白，通過競(jìng)爭(zhēng)性EMSA確定蛋白結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族，通過SupcrShiftEMSA確認(rèn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子類型。
　　 4.采用染色質(zhì)免疫共沉淀

5、(ChIP)確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子在胞內(nèi)對(duì)p28Gank啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　 5.通過p28GankLuciferase報(bào)告基因質(zhì)粒與其它如p300,CBP，IRAK1，HDAC1，HDAC2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，研究p300,CBP，IRAK1等對(duì)p28Gank轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)功能。
　　 6.采用RNA干擾技術(shù)，即p28GankLuciferase報(bào)告基因質(zhì)粒與NFYA，NFYB，CBP，p300,IRAK1siRNA共轉(zhuǎn)染反

6、向驗(yàn)證NFYA，NFYB，CBP，p300,IRAK1對(duì)p28Gank轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)功能。
　　 7.運(yùn)用核漿分離技術(shù)及WesternBlot，檢測(cè)HEK293經(jīng)刺激后，NFY-p300/CBP分子在胞核胞漿中的分布和變化；
　　 8.采用免疫共沉淀技術(shù)和WesternBlot研究NFYA乙酰化程度；
　　 9.采用DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型，研究從肝炎，肝硬化發(fā)展至肝癌過程中IL-β/IRAK1信號(hào)通路的激活情況及對(duì)

7、p28Gank轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響；
　　 10.采用熒光定量PCR，WesternBlot和免疫組化研究p28Gank和IRAK1在正常肝、肝硬化、癌旁組織及肝癌組織的表達(dá)，采用Kaplan-Meier方法分析生存期。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 1.生物信息學(xué)分析：p28Gank啟動(dòng)子屬于雙向TATA-lesspromotor，其核心啟動(dòng)子具有INR-DPE結(jié)構(gòu)。
　　 2.構(gòu)建了p28Gank啟動(dòng)子Luci

8、ferase報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4-p28Gank-1295bp-Luc和pGL4-p28Gank-280bp-Luc及其四個(gè)突變體pGL4-Gankyrin295bp-Luc，pGL4-Gankyrin△cSQ2-Luc，pGL4-Gankyrin△INR-LucpGL4-Gankyrin△DPE-Luc，確定了p28Gank的最小核心啟動(dòng)子范圍。證實(shí)了主要p28Gank啟動(dòng)子順式元件的功能。
　　 3.運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因系

9、統(tǒng)篩選對(duì)p28Gank轉(zhuǎn)錄活性有影響的藥物，發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和白介素1β(IL-1β)可促進(jìn)p28Gank轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)ClassⅠ&Ⅱ型組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和NaBu可提高p28Gank轉(zhuǎn)錄，蛋白酶體抑制劑MG-132和鈣通道阻滯劑苯磺酸氨氯地平(Amlodipine，AML)和粉防己堿(Tetrandrine，TET)可抑制p28Gank轉(zhuǎn)錄。
　　 4.采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)證明p28Gank啟動(dòng)子IN

10、R可結(jié)合蛋白，通過競(jìng)爭(zhēng)性EMSA確定了蛋白結(jié)合位點(diǎn)，采用轉(zhuǎn)錄因子一致識(shí)別序列競(jìng)爭(zhēng)性EMSA發(fā)現(xiàn)結(jié)合蛋白是NFY家族轉(zhuǎn)錄因子。通過SuperShiftEMSA確認(rèn)NFY-p300/CBP復(fù)合物結(jié)合于p28GankINR區(qū)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NFY-p300/CBP復(fù)合物與p28Gank啟動(dòng)子的體內(nèi)結(jié)合。
　　 5.NFYA、NFYB、irak1、CBP的siRNA敲除實(shí)驗(yàn)表明敲除NFYA、NFYB、IRAK1、CBP、p300后，

11、p28Gank轉(zhuǎn)錄活性下降，外轉(zhuǎn)染irak1，p300,CBP后，p28Gank轉(zhuǎn)錄活性上升，證實(shí)了NFY-p300/CBP復(fù)合物和IRAK1對(duì)p28Gank的調(diào)控功能。
　　 6.證實(shí)了IL-1β是通過激活I(lǐng)RAK1，引起p300,CBP高表達(dá)，進(jìn)而p300/CBP可使組蛋白乙?；蚇FYA乙?；?，從而激活p28Gank轉(zhuǎn)錄的途徑。
　　 7.依據(jù)上述結(jié)果，繪制了完整的p28Gank轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子模式圖。
　　

12、8.證實(shí)了在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中，肝炎，肝纖維化及肝癌過程中IL-1β/IRAK1信號(hào)通路的激活，并促進(jìn)了p28Gank轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 9.證實(shí)了肝癌組織中IL-1β和IRAK1的高表達(dá)，IRAK1和p28Gank的表達(dá)無論在mRNA水平還是蛋白水平，在正常肝，肝硬化和肝癌組織中表現(xiàn)出高度相關(guān)性。通過肝癌標(biāo)本組織芯片的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合p28Gank和IRAK1進(jìn)行免疫組化分析是預(yù)測(cè)早期肝癌預(yù)后的更好指標(biāo)。
　

13、　 [結(jié)論]
　　 本研究闡明了癌基因p28Gank的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，發(fā)現(xiàn)p28Gank核心啟動(dòng)子是具有INR-DPE結(jié)構(gòu)的雙向TATA-lesspromotor，其中INR可以結(jié)合NFY-p300/CBP復(fù)合物，控制著p28Gank的轉(zhuǎn)錄起始。具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄輔因子p300/CBP通過對(duì)組蛋白和NFYA乙?；龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄，而HDAC1和HDAC2則使組蛋白去乙酰化抑制p28Gank轉(zhuǎn)錄。本文還閘明了促炎性因子IL-1β

14、對(duì)p28Gank的轉(zhuǎn)錄激活作用并初步明確了其機(jī)理。IL-1β通過激活下游IRAK1上調(diào)p300/CBP表達(dá)，引起p28Gank轉(zhuǎn)錄激活。在DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中，證實(shí)了肝炎，肝纖維化及肝癌過程中IL-β/IRAK1信號(hào)通路的激活，并促進(jìn)了p28Gank轉(zhuǎn)錄表達(dá)。肝癌患者中IL-1β、IRAK1、p28Gank表達(dá)上調(diào)，其中IRAK1和p28Gank表達(dá)在mRNA和蛋白水平均密切相關(guān)，聯(lián)合p28Gank和IRAK1進(jìn)行免疫組化分析是預(yù)