IL-1β-IRAK1信號通路上調(diào)癌蛋白p28GANK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，簡稱肝癌）是惡性程度極高，預(yù)后極差的惡性腫瘤。我國是肝癌高發(fā)區(qū)，其致死率居所有腫瘤的第二位。它的發(fā)生以肝炎病毒感染及肝特異性致癌物為主要外因，同時也是體內(nèi)多基因參與、多步驟協(xié)同的復(fù)雜過程。近年來大量流行病學(xué)研究提示炎癥是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生或促進腫瘤發(fā)展的主要因素之一，約有15％-20％的惡性腫瘤由炎癥誘發(fā)或促進。原發(fā)性肝癌就是一種與炎癥密切相關(guān)的惡性

2、腫瘤，通常發(fā)生在慢性肝炎和肝硬化引起的慢性肝損傷基礎(chǔ)上。已有研究顯示致癌基因（如編碼蛋白絡(luò)氨酸激酶、RAS-R、β-catenin、轉(zhuǎn)錄因子c-myc的異常激活和腫瘤抑制蛋白的失調(diào)）可以誘導(dǎo)一些炎癥化學(xué)趨化因子和細胞因子，影響細胞外微環(huán)境的重塑，從而促進腫瘤微環(huán)境形成。表觀遺傳學(xué)因素的改變包括染色體重排，DNA甲基化，組蛋白乙?；?，RNA編輯和microRNA等在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用。比如DNA的甲基化沉默抑癌基因，去甲基化

3、激活癌基因;和組蛋白的乙?；せ畎┗虻?。
　　 癌基因p28GANK（又稱p28，Gankyrin，PSMD10）是經(jīng)消減雜交從人肝癌組織中篩選出的高表達基因，它編碼了重復(fù)ankyrin(ANK)序列。我們前期研究確認p28GANK為具有一定肝癌細胞特異性的癌蛋白，可作為肝細胞癌鑒別診斷的標(biāo)志物。p28GANK作為一重要的肝癌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控節(jié)點分子，參與調(diào)控Rb/E2F、MDM2/p53、NF-κB、PI3K/AKT、Wnt/β-c

4、atenin等多個信號通路，影響腫瘤細胞惡性增殖、抑制細胞凋亡、增強細胞轉(zhuǎn)移和侵襲等惡性行為;同時，p28GANK還通過調(diào)控干細胞調(diào)節(jié)的重要核轉(zhuǎn)錄因子Oct4，影響肝癌前體細胞的生物學(xué)功能促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。臨床樣本實驗顯示，肝癌組織中p28GANK的蛋白表達水平與患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，不僅作為分子分型和預(yù)后判斷的指標(biāo)，也是肝癌基因治療的新靶點。
　　 目前我們借助肝癌基因組二代測序技術(shù)，尚未發(fā)現(xiàn)p28GANK有突變或基因拷

5、貝數(shù)的增多。由此我們推測p28GANK在肝癌中高表達是由于其自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常引起的。前期我室研究發(fā)現(xiàn)炎性因子IL-1β和TNFα可以引起p28GANK轉(zhuǎn)錄活化，但是具體作用機制尚不清楚。已有諸多文獻報道，作為IL-1β下游的NF-κB信號通路在炎癥的相關(guān)腫瘤中扮演了舉足輕重的角色，它的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本課題進一步研究IL-1β/IRAK-1通路上調(diào)p28GANK的分子機制，探索其他的激活p28GANK轉(zhuǎn)錄的因素，

6、比如表觀遺傳學(xué)的因素。為更深的理解肝癌的發(fā)生發(fā)展機制和尋找靶向治療肝癌有效分子靶點提供理論線索。
　　 [實驗方法]
　　 1.構(gòu)建含有p28GANK啟動子區(qū)的熒光報告基因質(zhì)粒pGL4-p28GANK-Luc。
　　 2.建立穩(wěn)轉(zhuǎn)pGL4-p28GANK-Luc的HEK293細胞系。
　　 3.利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系篩選可以激活或抑制p28GANK的細胞因子或藥物。
　　 4.探索炎癥因子IL-1β，甲基

7、轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷，組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA上調(diào)p28GANK的機制。
　　 5.在細胞系上驗證IL-1β/IRAK1信號通路通過促進乙酰化酶活性上調(diào)p28GANK的可能機制。
　　 6.建立二乙基亞硝胺(DEN)誘癌大鼠模型，檢測誘癌過程中血清IL-1β變化，檢測在誘癌的過程中p28GANK，IRAK1的表達變化。
　　 7.收集臨床血清樣本，檢測正常人、肝炎、肝硬化和肝癌患者血清IL-1β的水平，比

8、較肝癌發(fā)生過程中血中IL-1β的變化情況和肝癌樣本中p28GANK，IRAK1的表達變化。
　　 8.在細胞系，正常人、肝硬化和肝癌患者的肝樣本中檢測p-IRAK1、p28GANK和IL-1β的表達。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1.成功構(gòu)建出含有p28GANK啟動子區(qū)的雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL4-p28GANK-Luc和穩(wěn)轉(zhuǎn)該質(zhì)粒的HEK293細胞系。
　　 2.運用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩選對p28

9、GANK轉(zhuǎn)錄活性有影響的藥物，發(fā)現(xiàn)ClassⅠ&Ⅱ型組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和NaBu，炎癥因子IL-1β，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷可提高p28GANK轉(zhuǎn)錄。
　　 3.證實了IL-1β是通過激活I(lǐng)RAK1，引起p300，CBP高表達，進而p300/CBP復(fù)合物可使組蛋白乙?；蚇FYA乙?；?，從而激活p28GANK轉(zhuǎn)錄的途徑。
　　 4.IL-1β通過激活JNK信號通路引起p300，CBP高表達，進而使組蛋白乙

10、?；蚇FYA乙?；?，從而激活p28GANK轉(zhuǎn)錄。
　　 5.在DEN誘癌模型中，血清IL-1β和蛋白水平在肝炎期表達升高，肝硬化期有所下降，肝癌時期又重新升高，p28GANK和IRAK1具有同樣的變化趨勢。
　　 6.肝硬化和肝癌患者血清IL-1β水平明顯高于正常人，肝炎患者IL-1β水平最高，提示IL-1β在肝炎肝硬化和肝癌的進程中起的作用不同。
　　 7.證實了肝癌組織中IL-1β和IRAK1的高表達，1R

11、AK1和p28GANK的表達無論在mRNA水平還是蛋白水平，在正常肝，肝硬化和肝癌組織中表現(xiàn)出高度相關(guān)性。
　　 8.p-IRAK和p28GANK在細胞系，正常人、肝硬化肝癌組織上都呈現(xiàn)高度相關(guān)，進一步驗證IL-1β/LRAK1信號通路激活可以上調(diào)p28GANK。
　　 [結(jié)論]
　　 本研究闡明了IL-1β/IRAK1炎性信號通路通過具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄輔因子p300/CBP對過對組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NFY

12、A乙?；瘡亩龠Mp28GANK的轉(zhuǎn)錄激活，確認NFY-p300/CBP復(fù)合物控制著p28GANK轉(zhuǎn)錄起始，而HDAC1和HDAC2則使組蛋白去乙酰化從而抑制p28GANK轉(zhuǎn)錄。p28GANK啟動子區(qū)甲基化對其轉(zhuǎn)錄激活沒有直接的影響。該研究為理解慢性肝炎發(fā)展至肝癌過程中，IL-1β/IRAK1炎性信號通路和癌蛋白p28GANK的作用提供了新的解釋，有助于人們更好的理解肝癌的發(fā)生機制，并可能為肝癌的預(yù)防和治療開辟新的思路。
　　 本