Dapper1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：Dapper1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究
　　研究目的：
　　肝癌是一種臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，惡性程度高，異質(zhì)性強(qiáng)，并且多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，往往預(yù)后不良。因此，從不同的分子水平和信號(hào)通路的異常表達(dá)對(duì)肝癌進(jìn)行分子水平的區(qū)別有對(duì)于肝癌的個(gè)體化治療是至關(guān)重要的。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中涉及到多個(gè)促癌信號(hào)的激活，Wnt/β-catenin

2、信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞分化、增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞的更新中起到重要作用。HCC中第二常見(jiàn)的特定位點(diǎn)基因突變即為促癌基因β-catenin的突變，突變比例約占20％-40％，因此Wnt/β-catenin通路的激活被認(rèn)為是可能用來(lái)對(duì)HCC進(jìn)行臨床分型的標(biāo)志之一。
　　Wnt通路的激活過(guò)程需要多種蛋白的共同參與，Wnt配體與受體FZD及其共受體LRP5或LRP6結(jié)合，募集腳手架蛋白DSH(Disshevelled，DSH)，該蛋

3、白使得LRP5或LRP6磷酸化，導(dǎo)致AXIN復(fù)合體被激活并大量募集到受體上。隨后AXIN被降解，β-catenin降解復(fù)合體也隨之解離，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中β-catenin聚集，游離的β-catenin可以移位到細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子集合，誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)。而Dapper(Dpr)則是作為能夠拮抗Wnt通路中腳手架蛋白DSH功能的一類蛋白被發(fā)現(xiàn)。Dpr的同源物包括Dpr1、Dpr2和Dpr3，編

4、碼人Dpr1的基因?yàn)镈ACT1，位于第14號(hào)染色體上。Dpr1在胚胎發(fā)育過(guò)程中可以調(diào)控Wnt信號(hào)通路，另有研究報(bào)道了其核轉(zhuǎn)運(yùn)與核定位信號(hào)，證明Dpr1還可通過(guò)核漿穿梭在胞核和胞漿中以不同方式調(diào)控Wnt通路的活性。腫瘤領(lǐng)域的研究表明Dpr1在肝癌患者癌組織中呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)，并且這種下調(diào)伴隨著胞漿中β-catenin的積累，然而Dpr1在肝臟中表達(dá)及其在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究探討。
　　自噬是細(xì)胞在基礎(chǔ)

5、條件和應(yīng)激下維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝方式，在肝臟正常生理機(jī)能維持和肝臟疾病的病理進(jìn)展中起著重要的作用。自噬調(diào)節(jié)異常與病毒性肝病、非酒精性肝脂肪性變、酒精性肝病、肝纖維化、肝硬化以及肝癌密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為自噬在肝癌的進(jìn)展過(guò)程中起著雙重作用，即自噬在腫瘤形成和腫瘤抑制這兩個(gè)過(guò)程中均有作用。目前研究表明自噬相關(guān)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)于肝細(xì)胞癌的診斷和治療方式的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。
　　p62是自噬過(guò)程中重要的底物與接頭分子，在多種肝臟

6、疾病中可以觀察到p62的高表達(dá)，例如非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、肝細(xì)胞癌等。大量報(bào)道表明p62可以通過(guò)調(diào)控NRF2信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、mTORC1信號(hào)通路、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。目前研究表明過(guò)表達(dá)p62誘導(dǎo)NRF2與mTORC1的激活以及c-Myc的表達(dá)，可以促進(jìn)小鼠中肝細(xì)胞癌的起始。p62累積導(dǎo)致的NRF2瞬時(shí)性激活可以保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激及環(huán)境中毒素的損傷，然而自噬功能受損導(dǎo)致

7、的p62蓄積和持續(xù)的NRF2激活則會(huì)導(dǎo)致肝癌的形成。因此，如何通過(guò)藥理學(xué)研究開(kāi)發(fā)抑制p62累積及NRF2和mTORC1持續(xù)激活的制劑是將來(lái)研究抗HCC藥物的一個(gè)突破點(diǎn)。
　　近期研究表明Dpr1也具有調(diào)控細(xì)胞自噬的作用，研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Dapper1可以通過(guò)促進(jìn)Beclin1-Vps34-Atg14L復(fù)合體的形成促進(jìn)自噬。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們?cè)隗w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)Dpr1與自噬水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān);且在肝細(xì)胞特異性敲除Dpr1的

8、小鼠DEN誘癌模型中，Dpr1敲除的小鼠肝癌成瘤性顯著增強(qiáng)。
　　Dpr1調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的機(jī)制已得到較完善的闡釋，然而在肝細(xì)胞癌背景下Dpr1是否影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，是否調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路或影響肝臟細(xì)胞自噬水平的變化，以及上述通路變化對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的作用均有待進(jìn)一步研究探討?；谝陨媳尘埃菊n題旨在探討Dpr1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，相關(guān)信號(hào)通路變化及其下游效應(yīng)，進(jìn)而評(píng)估Dpr1作為肝癌臨床診斷、預(yù)后判斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的

9、潛在價(jià)值。
　　研究方法：
　　1.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者中Dpr1的表達(dá)量，初步探討Dpr1表達(dá)量在肝癌形成中的作用。
　　2.將Alb-Cre小鼠與Dpr1-Loxp小鼠雜交，鑒定肝細(xì)胞特異性敲除Dpr1的小鼠。利用腹腔注射DEN與CCl4誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌，收集誘癌過(guò)程中（誘癌1.5月、2月、2.5月及3月）小鼠肝臟樣本，誘癌4個(gè)月觀察小鼠肝臟腫瘤形成情況，初步確定Dpr1在肝癌形成過(guò)程中的作用，并比較與

10、肝癌患者中的觀察是否一致。
　　3.RT-PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中Dpr1表達(dá)情況，選擇Dpr1低表達(dá)的細(xì)胞系Huh7及LM3通過(guò)慢病毒體系構(gòu)建Dpr1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。利用該細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn),觀察Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞成瘤的差異，進(jìn)一步明確Dpr1對(duì)于腫瘤形成的影響。
　　4.分離Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟原代細(xì)胞，通過(guò)Western Blot檢測(cè)原代細(xì)胞中自噬相關(guān)分子(p62及LC3-Ⅱ等)表

11、達(dá)量。同時(shí)在上述穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Dpr1細(xì)胞系中檢測(cè)自噬相關(guān)分子的表達(dá);用Ad-GFP-RFP-LC3Ⅱ監(jiān)測(cè)自噬流的變化，并對(duì)自噬小體及自噬溶酶體進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)其相對(duì)值，明確Dpr1過(guò)表達(dá)及敲除后對(duì)自噬的影響;在培養(yǎng)體系中去血清饑餓培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，明確饑餓誘導(dǎo)條件下Dpr1對(duì)自噬的影響。
　　5.在上述DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟樣本中檢測(cè)自噬相關(guān)分子的表達(dá)，探討在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中Dpr1

12、對(duì)自噬的影響以及與肝細(xì)胞癌形成的關(guān)系。
　　6.檢測(cè)上述穩(wěn)定表達(dá)Dpr1細(xì)胞系及原代分離的Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)下細(xì)胞衰老表型的差異;利用ROS試劑盒檢測(cè)上述穩(wěn)定表達(dá)Dpr1細(xì)胞系及Dact1 hep-/-與WT小鼠原代細(xì)胞中ROS的生成并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化量化。
　　7.檢測(cè)上述DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟新鮮組織冰凍切片中細(xì)胞衰老情況，探討在腫瘤形成過(guò)程

13、中Dpr1對(duì)細(xì)胞衰老的關(guān)系;通過(guò)RT-PCR及Western Blot檢測(cè)衰老相關(guān)分子p53、p21、p16等的表達(dá)量，明確Dpr1影響細(xì)胞衰老的上游信號(hào)通路。
　　8.檢測(cè)上述DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵分子的表達(dá)，明確Dpr1在肝細(xì)胞癌形成過(guò)程中對(duì)DNA損傷的影響;通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝癌癌前病變，高度不典型增生結(jié)節(jié)標(biāo)志性分子，觀察Dpr1在腫瘤形成前期對(duì)癌前病變形成的

14、作用。
　　9.收集Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠DEN加CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌2月的新鮮樣本，固定后電鏡觀察兩組小鼠自噬小體形成，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)及糖原累積情況等變化。
　　10.通過(guò)Western Blot檢測(cè)DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝臟樣本中與自噬、細(xì)胞衰老及DNA損傷相關(guān)上游通路的關(guān)鍵分子，例如p-Akt信號(hào)通路，p62-Nrf2信號(hào)通路等。
　　11.通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在293T中過(guò)表達(dá)Dpr1

15、，以及利用Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠原代細(xì)胞，觀察Dpr1對(duì)PTEN降解的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。
　　12.利用IP等方法探討Dpr1與自噬等信號(hào)通路中關(guān)鍵分子相互作用的可能性，并利用后續(xù)敲除或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證，觀察其對(duì)上述自噬、衰老、DNA損傷應(yīng)答等表型的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過(guò)RT-PCR檢測(cè)44例肝細(xì)胞癌患者肝癌及癌旁組織樣本中Dpr1的表達(dá)量，與癌旁組織相比，肝癌組織中Dpr1呈現(xiàn)低表達(dá)。

16、
　　2.Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠進(jìn)行DEN加CCl4誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌4個(gè)月，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠肝臟成瘤數(shù)目明顯多于對(duì)照小鼠，說(shuō)明Dpr1敲除后促進(jìn)小鼠肝臟腫瘤形成，與肝癌患者中觀察一致。
　　3.利用慢病毒體系建立MHCC-LM3及Huh7過(guò)表達(dá)Dpr1及GFP細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤，4周后發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Dpr1組皮下腫瘤明顯小于對(duì)照組，表明Dpr1抑制腫瘤的形成。
　　4.Western Blot檢

17、測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞系中自噬相關(guān)分子p62，LC3-Ⅱ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Dpr1后，細(xì)胞自噬水平升高，而原代分離的Dact1hep-/-肝細(xì)胞中自噬水平顯著低于WT小鼠肝細(xì)胞;利用Ad-RFP-GFP-LC3-Ⅱ系統(tǒng)檢測(cè)自噬流也提示隨著Dpr1表達(dá)量升高，自噬溶酶體/自噬小體比例明顯增高，提示自噬能力增強(qiáng)。去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬也發(fā)現(xiàn)饑餓誘導(dǎo)后Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞自噬能力的增強(qiáng)高于對(duì)照組。
　　5.利用Western Blot檢測(cè)DEN誘導(dǎo)肝

18、細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟樣本中自噬相關(guān)分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠肝臟樣本中p62表達(dá)高于對(duì)照組而LC3-Ⅱ表達(dá)量較低，說(shuō)明誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌發(fā)生的過(guò)程中，Dact1hep-/-小鼠肝臟自噬水平均較對(duì)照組更低。
　　6.穩(wěn)定表達(dá)Dpr1的肝癌細(xì)胞系中利用β-gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Dpr1過(guò)表達(dá)Huh7肝癌細(xì)胞系，衰老細(xì)胞比例明顯多于對(duì)照細(xì)胞;而原代分離的Dact1hep-/-小

19、鼠肝細(xì)胞中本底情況下衰老細(xì)胞比例則少于對(duì)照組;原代細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及衰老，WT原代肝細(xì)胞中隨H2O2濃度增高，細(xì)胞衰老比例呈增加趨勢(shì)，而Dacthep-/-細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞衰老效果并不顯著。利用MitoSOX RED檢測(cè)細(xì)胞中ROS的含量，Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中ROS含量均明顯高于對(duì)照組;而原代分離Dpr1hep-/-小鼠肝細(xì)胞中ROS含量則明顯低于WT小鼠肝細(xì)胞;以上表明Dpr1誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，可能是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的

20、原因之一。
　　7.利用β-gal染色檢測(cè)上述DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Dact1 hep-/-小鼠與WT小鼠肝臟新鮮組織冰凍切片中細(xì)胞衰老，Dact1 hep-/-小鼠肝細(xì)胞中幾乎并未觀察到β-gal陽(yáng)性染色，而WT小鼠DEN誘癌2月和3月肝臟組織中則出現(xiàn)大量細(xì)胞衰老;DEN誘癌4月形成的腫瘤組織中，兩組小鼠均未見(jiàn)明顯衰老陽(yáng)性細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)原代分離Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠肝細(xì)胞p53與p21的表達(dá)，結(jié)果提

21、示W(wǎng)T小鼠肝細(xì)胞中p53與p21的表達(dá)均略高于Dact1hep-/-小鼠。Western Blot檢測(cè)DEN誘導(dǎo)肝癌過(guò)程不同時(shí)間點(diǎn)樣本中p53及p21的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)WT小鼠肝臟組織中p53與p21表達(dá)高于Dact1hep-/-小鼠。
　　8.利用Western Blot檢測(cè)上述DEN誘癌不同時(shí)間點(diǎn)Dact1hep-/-小鼠與WT小鼠石蠟樣本切片中DNA損傷關(guān)鍵分子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠樣本中p-p53、γ-H2A

22、X等DNA損傷標(biāo)志物表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。通過(guò)HE及免疫組織化學(xué)檢測(cè)DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌3個(gè)月的小鼠肝臟樣本中肝癌前病變標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠肝臟樣本中 HGDN數(shù)量顯著多于對(duì)照組小鼠。
　　9.電鏡觀察DEN誘癌2月Dact1 hep-/-小鼠及對(duì)照小鼠樣本，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠組織中自噬小體數(shù)量明顯少于對(duì)照組，且觀察到明顯糖原累積及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。
　　10.檢測(cè)DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Da

23、ct1 hep-/-小鼠與WT小鼠組織樣本中p-Akt相關(guān)通路變化，發(fā)現(xiàn)Dact1hep-/-小鼠樣本中p-Akt信號(hào)通路明顯激活，且PTEN表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。
　　11.在293T細(xì)胞中梯度過(guò)表達(dá)Dpr1后可以檢測(cè)到PTEN表達(dá)隨Dpr1梯度增加呈現(xiàn)表達(dá)升高趨勢(shì)。293T中過(guò)表達(dá)Dpr1-myc及對(duì)照質(zhì)粒后加入CHX抑制蛋白合成，發(fā)現(xiàn)PTEN降解在Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中減慢。
　　12.293T中同時(shí)過(guò)表達(dá)PTEN-His、H

24、A-Ubiquitin、Dpr1-myc作為實(shí)驗(yàn)組，PTEN-His、HA-UB、Pll-GFP作為對(duì)照組，IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中His-tag抗體可以成功捕獲HA-UB，表明Dpr1過(guò)表達(dá)后出現(xiàn)泛素化PTEN的累積，可能由于其降解能力減弱所致。
　　結(jié)論：
　　在DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型中，Dact1hep-/-小鼠肝細(xì)胞癌成瘤能力顯著高于WT小鼠，提示在該模型中Dpr1對(duì)于肝癌形成具有抑制作用。對(duì)肝癌患者癌及癌旁

25、樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Dpr1在肝癌患者癌組織中低表達(dá)，進(jìn)而明確了Dpr1的抑癌作用。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Dact1 hep-/-小鼠及WT小鼠原代肝細(xì)胞以及Dpr1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及對(duì)照肝癌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，Dpr1干擾后細(xì)胞自噬水平顯著降低，細(xì)胞衰老減慢且DNA損傷加重，以上生物學(xué)過(guò)程的改變?cè)贒EN誘癌過(guò)程中共同導(dǎo)致Dact1hep-/-小鼠肝細(xì)胞成瘤性增強(qiáng)。進(jìn)一步的機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)Dact1 hep-/-小鼠成瘤過(guò)程中PTEN表達(dá)量下調(diào)同時(shí)p-Akt信號(hào)通路活性

26、增強(qiáng)。研究表明Dpr1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的泛素化PTEN堆積，提示PTEN降解速率減慢，Dpr1可能參與PTEN穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。這一效應(yīng)可能是由于肝細(xì)胞自噬受阻后p62介導(dǎo)泛素化PTEN降解減慢所致，具體機(jī)制仍需后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。我們還將通過(guò)Dpr1截?cái)囿w探索其作用的具體位點(diǎn)，闡釋Dpr1作用于PTEN的具體分子機(jī)制，探討其對(duì)肝癌治療及預(yù)后判斷潛在的作用。
　　第二部分HBx調(diào)節(jié)HMGBl分泌促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的作用及機(jī)制研究
　

27、　研究目的：
　　肝細(xì)胞癌CHCC)是最為常見(jiàn)的腫瘤之一，在腫瘤導(dǎo)致的死亡中位居第三。乙型病毒性肝炎病毒(HBV)感染是公認(rèn)的HCC的主要危險(xiǎn)因子。HBV感染可以引起肝炎-肝纖維化-肝硬化的進(jìn)展，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生。肝細(xì)胞癌患者通常預(yù)后不良，而腫瘤肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的重要因素。在HBV引起的肝癌患者中接受肝切除術(shù)后仍然可能伴有HBV的活化，HBV活性的持續(xù)同樣影響患者的預(yù)后。有資料表明持續(xù)的抗病毒治療可以有效延長(zhǎng)患

28、者的生存期，而術(shù)后抗病毒治療也有望減輕病毒的負(fù)載，緩解肝臟炎性反應(yīng)，進(jìn)而提高患者術(shù)后生存率。
　　HBV基因組DNA由4段部分重疊的開(kāi)放閱讀框構(gòu)成，其中X區(qū)域編碼HBVx蛋白(HBx),HHx蛋白是一段17kd大小的可溶性蛋白，在宿主細(xì)胞的胞核和胞漿廣泛分布，在HBV導(dǎo)致的肝癌進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。一方面，HBx通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖以及遷移促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展。另外，HBx還可影響轉(zhuǎn)錄因子活性，上調(diào)RaslRaf/MAPK，PI

29、3K/Akt等關(guān)鍵信號(hào)通路活性促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。然而，HBx與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制卻仍未被完全闡明。
　　HMGB1作為一種進(jìn)化上相對(duì)保守的染色體結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)，早期報(bào)道表明其作為DNA的分子伴侶發(fā)揮增強(qiáng)染色體穩(wěn)定性的作用。近年來(lái)的報(bào)道表明，HMGB 1不僅可以作為敗血癥晚期系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，而且在肝臟缺血再灌注損傷早期被分泌到細(xì)胞外而發(fā)揮作用。同時(shí)，HMGB1與一些惡性腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，例如肝細(xì)胞癌，前列腺癌、乳腺

30、癌、結(jié)腸癌等。在缺氧的腫瘤微環(huán)境下，肝癌細(xì)胞可以釋放HMGB1,從而引起下游的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　因此，本課題旨在探討HBx促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制以及HMGB1在其中的介導(dǎo)作用。根據(jù)本課題組前期的文獻(xiàn)閱讀和預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提出以下假設(shè):HBx通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞分泌HMGB1，引起下游級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，加速肝癌進(jìn)展。本課題將首先驗(yàn)證此猜想的科學(xué)性，進(jìn)而深入探討HBx促進(jìn)肝癌細(xì)

31、胞分泌HMGB 1的具體分子機(jī)制。HMGB1在患者血清及肝組織的水平或可作為預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)，同時(shí)利用HMGB1中和抗體封閉HMGB1的活性或可作為乙肝相關(guān)肝癌患者潛在的治療策略。因此本課題關(guān)于HBx促進(jìn)促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞分泌HMGB1的作用及機(jī)制研究可為臨床肝癌患者的分子分型及個(gè)體化治療提供新的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.收集肝細(xì)胞癌患者肝癌與癌旁組織，制作組織芯片，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)芯片中組織HMGB 1的

32、表達(dá)情況，利用組織染色評(píng)分軟件對(duì)胞漿中HMGB 1染色進(jìn)行評(píng)分。整理上述組織芯片中患者的臨床資料以及隨訪預(yù)后資料，根據(jù)HMGB1胞漿著色評(píng)分的中位數(shù)，將患者分為HMGB1胞漿高表達(dá)組(評(píng)分高于中位數(shù))和低表達(dá)組(評(píng)分低于中位數(shù))，結(jié)合患者總體生存期，復(fù)發(fā)時(shí)間等進(jìn)行患者預(yù)后分析，明確HMGB I與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系;結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行生存和復(fù)發(fā)的單因素及多因素分析;分析患者胞漿HMGB1染色與HBV DNA滴度之間的關(guān)系。
　　

33、2.選取不同HBV DNA滴度的肝癌患者，根據(jù)HBV復(fù)制活躍程度分組:HBV DNA>lOSIU/mL; 103　　3.用RTPCR檢測(cè)肝癌患者組織樣本中HBx的表達(dá)水平，將該樣本進(jìn)行核漿分離，利用We

34、stern Blot檢測(cè)HMGB1在胞漿中的表達(dá)量并進(jìn)行灰度定量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析肝癌患者胞漿中HMGB1表達(dá)與組織中HBx表達(dá)量之間的相關(guān)性。
　　4.利用慢病毒體系建立肝細(xì)胞癌細(xì)胞系過(guò)表達(dá)HBx及對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞系，利用ELISA和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的分泌水平及時(shí)間依賴性。
　　5.利用腺病毒系統(tǒng)感染肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，建立短時(shí)的過(guò)表達(dá)HBx及對(duì)照GFP的模型，利用ELISA和Western B

35、lot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的分泌水平及時(shí)間依賴性；在上述建立的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)HBx及對(duì)照的肝癌細(xì)胞系中，利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察過(guò)表達(dá)HBx后是否存在HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位。
　　6.通過(guò)Transwell技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系的侵襲性，在培養(yǎng)體系中加入重組HMGB1蛋白，或HMGB 1中和抗體封閉分泌型HMGB 1活性后，觀察肝癌細(xì)胞系侵襲性的變化。
　　7.利用慢病毒系統(tǒng)建立構(gòu)建過(guò)表達(dá)HBx-Luc及GFP-Luc的肝癌細(xì)

36、胞系，NOD-SCID小鼠尾靜脈注射上述表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞系建立肺轉(zhuǎn)移模型，定期通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的情況，比較兩組細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移特性;給予PBS或者HMGB 1中和抗體進(jìn)行干預(yù)性治療，比較各組小鼠活體成像信號(hào)強(qiáng)弱;處死各組小鼠后，比較大體肺轉(zhuǎn)移瘤大小及個(gè)數(shù)，收集各組小鼠肺組織樣本;對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HE染色，計(jì)數(shù)各組小鼠肺中微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目;同時(shí)對(duì)肺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察各組HMGB 1染色情況，比較HBx

37、過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組中胞漿內(nèi)HMGB1的表達(dá)量，對(duì)比HMGB1中和抗體處理之后，胞漿中HMGB1染色的變化。
　　8.利用細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子特異性探針，比較HBx過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系中細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的含量。給予鈣離子拮抗劑BAPTA-AM處理細(xì)胞系后，比較細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1的濃度，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化以及用Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲性。
　　9.在上述小鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型中，給予PBS或者BAPTA-A

38、M進(jìn)行治療性干預(yù)，活體成像系統(tǒng)觀察小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況;定期取各組小鼠血清，檢測(cè)血清中HMGB1的濃度;處死小鼠后比較小鼠肺上轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和大小;對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HE染色，比較各組中肺上微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目;對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HMGB 1細(xì)胞免疫化學(xué)染色，比較轉(zhuǎn)移灶中胞漿內(nèi)HMGB1的分泌。
　　10.在穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞系及腺病毒感染HBx或者對(duì)照病毒的細(xì)胞系中，培養(yǎng)體系中加入鈣離子相關(guān)通路的抑制劑，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)H

39、MGB1的分泌量;利用Transwell體系，檢測(cè)加入抑制劑后兩組細(xì)胞的侵襲性變化；通過(guò)上述方法明確HBx調(diào)節(jié)HMGB1分泌所涉及的鈣離子相關(guān)性通路。
　　研究結(jié)果：
　　1.肝癌細(xì)胞SMMC-7721及MHCC-LM3過(guò)表達(dá)HBx后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1分泌明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞免疫熒光可觀察到明顯的HMGB1胞漿轉(zhuǎn)位，提示HBx促進(jìn)HMGB1的分泌。
　　2.肝癌細(xì)胞SMMC-7721及MHCC-LM3培養(yǎng)體系中

40、加入重組HMGB1蛋白后，細(xì)胞侵襲性明顯增強(qiáng);肝癌細(xì)胞系過(guò)表達(dá)HBx后，細(xì)胞穿膜能力明顯增強(qiáng)，而在Transwell體系中加入HMGB1中和抗體后，細(xì)胞侵襲性明顯減弱到與對(duì)照組相似的水平。
　　3.在小鼠尾靜脈注射肝癌細(xì)胞系肺轉(zhuǎn)移模型中，注射HBx組細(xì)胞系小鼠肺活體成像信號(hào)明顯強(qiáng)于對(duì)照組;定期眼球后取血檢測(cè)血清中HMGB 1濃度，發(fā)現(xiàn)注射HBx過(guò)表達(dá)組細(xì)胞系的小鼠血清中HMGB 1水平更高;給予HMGB 1中和抗體干預(yù)后，注射HB

41、x過(guò)表達(dá)組小鼠肺部活體成像信號(hào)明顯減弱，處死小鼠后肺轉(zhuǎn)移瘤大小和數(shù)目均明顯低于PBS組；肺組織HE染色中，使用HMGB1中和抗體治療組小鼠肺部微轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯少于對(duì)照HBx組小鼠，同時(shí)HMGB1免疫組織化學(xué)染色中胞漿著色減弱至類似于注射GFP組細(xì)胞的水平。以上提示:在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，阻斷HMGB 1的活性可以有效減輕HBx過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移。
　　4.在過(guò)表達(dá)HBx及對(duì)照質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系中加入細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可以有效抑制細(xì)胞培

42、養(yǎng)上清中HMGB1的分泌并且伴隨細(xì)胞侵襲能力的減弱;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移模型中，給予BAPTA-AM干預(yù)后，小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成明顯減少，胞漿內(nèi)HMGB1水平也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。以上提示HBx促進(jìn)HMGB1的分泌從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移依賴于細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高。
　　5.在過(guò)表達(dá)HBx及對(duì)照質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系中加入CAMKK及CAMKIV抑制劑，可以 有效抑制細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB 1的分泌，同時(shí)可觀察到HBx過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲性下降。提

43、示HBx調(diào)節(jié)HMGB 1分泌是通過(guò)Cat+-CAMKK-CAMKIV通路介導(dǎo)的。
　　6.肝癌患者組織芯片進(jìn)行HMGB 1免疫組織化學(xué)染色及胞漿HMGB 1著色評(píng)分，根據(jù)評(píng)分中位數(shù)將患者分為HMGB 1高表達(dá)組及HMGB 1低表達(dá)組，生存分析發(fā)現(xiàn)HMGB 1高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。同時(shí)，肝癌患者血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清中HMGB 1 水平與患者HBV DNA滴度呈現(xiàn)正相關(guān)，與組織芯片中肝癌細(xì)胞胞漿中HMGB1水平與患者HBV滴度的相關(guān)性

44、分析結(jié)果一致。
　　結(jié)論：本研究證實(shí)HBx蛋白通過(guò)Ca+-CAMKK-CAMKIV信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中HMGB1的分泌，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良。使用HMGB1中和抗體封閉HMGB1的作用或Ca+-CAMKK-CAMKIV通路的抑制劑均可以有效的抑制HBx促進(jìn)的HMGB1的分泌，抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。肝癌患者血清HMGB1水平或可指導(dǎo)HBV相關(guān)肝癌患者預(yù)后判斷，抑制HMGB1分泌的干預(yù)性治療有望成為HBV相