重金屬耦合劑和抗氧化劑在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟前老化中的保護(hù)作用.pdf

1、第一部分：小鼠卵母細(xì)胞體外成熟前老化的染色體及線粒體分布變化
　　研究背景：
　　近年來(lái)，臨床生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，為無(wú)數(shù)不孕不育夫妻解決了生育小孩的問(wèn)題。而由于工作壓力及生活等各種因素，許多婦女常常只能大齡生育。然而，在絕經(jīng)期來(lái)臨之前，女性生殖力明顯呈現(xiàn)出與年齡相關(guān)的下降趨勢(shì)。隨著年齡的增長(zhǎng)，尤其是超過(guò)35歲，卵子數(shù)量和卵母細(xì)胞的質(zhì)量逐漸下降，從而導(dǎo)致越來(lái)越多不孕的問(wèn)題。因此，卵母細(xì)胞衰老的問(wèn)題受到越來(lái)多的關(guān)注。由

2、于胚胎細(xì)胞質(zhì)幾乎直接來(lái)源于卵母細(xì)胞，因此卵母細(xì)胞的質(zhì)量直接影響胚胎的后續(xù)發(fā)育能力。在輔助生殖技術(shù)(ART)中，患者進(jìn)行控制性促排卵(COH)治療時(shí)，由于臨床上促排卵方案種類繁多，需要根據(jù)患者個(gè)體化進(jìn)行選擇，因此每個(gè)患者在 HCG刺激排卵前所用的促排卵的方案及所用時(shí)間各有不同。然而，當(dāng)不同卵母細(xì)胞在不同卵泡中刺激發(fā)育時(shí)并不完全是同步的，有些卵子在卵泡中發(fā)育得比較快，而有些卵子發(fā)育得較慢，這些不同步發(fā)育的卵子在 HCG同一時(shí)間進(jìn)行刺激排卵時(shí)

3、，就會(huì)出現(xiàn)較早開始發(fā)育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了，而有些卵子仍然處于年輕的階段。我們把這種在促性腺激素刺激排卵前卵子在 GV期就發(fā)生老化的過(guò)程稱為“卵子成熟前老化”。這種情況在ART的患者中很常見，也會(huì)在高齡婦女或PCOS患者中常常發(fā)生，這也可能是這些患者卵子質(zhì)量低下胚胎發(fā)育不良的原因之一。同時(shí)，這也可能是ART中患者取出的卵子數(shù)量很多，而最后形成正常胚胎進(jìn)行移植的數(shù)量很少的原因之一，因?yàn)槲闯墒斓穆炎釉诔墒烨熬桶l(fā)生老化

4、，會(huì)改變卵子的受精結(jié)局，非整倍體或染色體異常經(jīng)常被認(rèn)為是導(dǎo)致卵子不能受精或受精后形成染色體異常的胚胎，從而導(dǎo)致移植失敗的重要原因之一。而線粒體作為細(xì)胞中的主要產(chǎn)能場(chǎng)所，其分布及功能的變化也會(huì)極大的影響著細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。很少有人在這些成熟前就發(fā)生老化的未成熟的卵子上面進(jìn)行研究，老化的卵子的染色體情況及其線粒體分布的變化目前仍然未知。了解成熟前老化的GV卵子的染色體結(jié)構(gòu)及線粒體分布的變化為有利于闡明成熟前老化卵母細(xì)胞的低發(fā)育潛

5、能和高損失率的機(jī)制，同時(shí)為在臨床上提高老化卵子的質(zhì)量提供新的思路。
　　研究目的：
　　在本研究中我們通過(guò)體外小鼠未成熟卵母細(xì)胞用IBMX使其在GV期分別停止發(fā)育12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)，模擬體內(nèi)卵子不同時(shí)間段成熟前老化的狀態(tài)，隨后進(jìn)行進(jìn)一步體外成熟，檢查其染色體是否異常及成熟前老化的GV期卵子的染色體和線粒體分布情況與成熟率是否相關(guān)，為了解老化卵子低成熟率和胚胎低發(fā)育率的機(jī)制有重要的作用，同時(shí)為提高卵子質(zhì)量提供理論依據(jù)

6、和提供新策略。
　　研究方法：
　　1.體外培養(yǎng)體系中加入3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，對(duì)小鼠未成熟卵子進(jìn)行體外老化及體外成熟處理。
　　拾獲的小鼠未成熟卵母細(xì)胞分為四組：1)成熟前老化0小時(shí)組(0hrs);2)成熟前老化12小時(shí)組(12hrs);3)成熟前老化24小時(shí)組(24hrs組);4)成熟前老化36小時(shí)組(36hrs組)；5)體內(nèi)成熟的小鼠卵母細(xì)胞
　　1.1.實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行PMSG促卵母細(xì)胞發(fā)育

7、，體內(nèi)成熟的卵子HCG促排卵。
　　1.2.GV期未成熟卵母細(xì)胞和MII期成熟卵母細(xì)胞的收集。
　　1.3.三組卵母細(xì)胞分別體外成熟前老化12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)，0小時(shí)組直接體外成熟。
　　1.4.三組卵母細(xì)胞成熟前老化后移除IBMX，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。
　　2.對(duì)新鮮體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞和不同老化時(shí)間的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟率和染色體、線粒體的檢查。
　　2.1.GVBD率和MII率。
　　計(jì)算每個(gè)

8、組核膜破裂消失(GVBD)的卵子數(shù)量和第一極體卵子吐出(MII)成熟階段的卵子數(shù)量。
　　2.2.MII期卵母細(xì)胞染色體檢查
　　體內(nèi)成熟的新鮮卵子及不同時(shí)期體外老化的卵子每組隨機(jī)挑選10枚進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增和染色體CNV檢查。
　　2.3.線粒體活動(dòng)分布。
　　Mitotracker Red CMXRos對(duì)GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行線粒體分布檢查。
　　研究結(jié)果：
　　1.小鼠未成熟卵子體外老化后卵子成

9、熟率下降。
　　2.體外成熟前老化時(shí)間延長(zhǎng)，染色體異常數(shù)量增多。
　　3.卵母細(xì)胞成熟前老化時(shí)間越長(zhǎng)，線粒體異常分布增高。
　　研究結(jié)論：
　　1、新鮮體內(nèi)/體內(nèi)成熟的卵子染色體大多數(shù)正常，體外成熟前老化的卵母細(xì)胞在體外老化時(shí)間越長(zhǎng)，其染色體異常的卵子數(shù)量明顯增多，同時(shí)出現(xiàn)非整倍體的幾率也隨之升高。
　　2、成熟前老化越嚴(yán)重，其線粒體活力下降，染色體異常率升高，從而影響卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟及發(fā)育的能力，這很可

10、能是衰老卵子其胚胎形成率及發(fā)育能力低下的重要原因。
　　第二部分：重金屬耦合劑和抗氧化劑在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟前老化中的保護(hù)作用
　　研究背景
　　不孕癥近年在人群中是一個(gè)很大的健康問(wèn)題。隨著女性生育年齡的增高，越來(lái)越多的夫婦需要依靠輔助生殖技術(shù)（ART）獲得懷孕,因此輔助生殖技術(shù)是不孕患者取得懷孕的希望。就目前而言，隨著女性生育年齡不斷推遲，導(dǎo)致卵子老化的問(wèn)題日益嚴(yán)重，同時(shí)也為輔助生殖技術(shù)提出更高要求。毫無(wú)疑問(wèn)，健康

11、的卵子是成功受精，胚胎移植和后續(xù)移植后成功種植的重要保證。然而，在ART中，患者進(jìn)行控制性促排卵治療時(shí)，當(dāng)不同卵母細(xì)胞在不同卵泡中發(fā)育時(shí)并不全是同步的，當(dāng)有些卵子在卵泡中發(fā)育得較其他卵子快時(shí)，這些卵子在HCG刺激卵子排卵時(shí)，這些較早發(fā)育的卵子就有可能在HCG排出前在GV期就老化了，我們把這種在促性腺激素刺激排卵前卵子就發(fā)生老化的過(guò)程稱為“卵子成熟前老化”。這種情況在輔助生殖技術(shù)中很常見，這也可能是這些患者卵子質(zhì)量低下胚胎發(fā)育不良的原因之

12、一。
　　未成熟卵子在其成熟前就發(fā)生老化會(huì)改變卵子的受精結(jié)局。在影響輔助生殖技術(shù)的各種不利因素中，氧化應(yīng)激(OS)被認(rèn)為是影響卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的重要因素之一。氧化應(yīng)激來(lái)源于活性氧（ROS）與生物抗氧化劑之間的平衡被打破，造成活性氧濃度增高，而高濃度活性氧會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的正常生命活動(dòng)，造成細(xì)胞DNA損傷，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂類改變，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
　　人類在許多不同生殖狀態(tài)下都存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，尤其是在

13、進(jìn)行輔助生殖技術(shù)（ART）過(guò)程中，體外操作不能完全模擬真實(shí)的體內(nèi)生理?xiàng)l件，多種因素都可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生和增加，當(dāng)其作用于精子、卵子及胚胎等，影響胚胎著床，從而影響 ART治療的結(jié)局。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)重金屬也可以使卵子內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高從而影響卵子發(fā)育能力。
　　目前來(lái)說(shuō)，很多研究都發(fā)現(xiàn)重金屬耦合劑或抗氧化劑在卵子和胚胎發(fā)育有利于卵母細(xì)胞/胚胎的發(fā)育，基本都是從單一種類的重金屬耦合劑或抗氧化劑來(lái)說(shuō)明問(wèn)題，但很少研究會(huì)涉及單一藥物

14、或/和混合藥物添加對(duì)成熟前老化卵子的影響。而且，目前，幾乎所有研究都關(guān)注卵母細(xì)胞減數(shù)分裂后的狀態(tài)，很少報(bào)道其對(duì)卵母細(xì)胞成熟前老化的影響，也沒(méi)有研究重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)GV期成熟前老化的卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能和質(zhì)量是否有影響。在人類輔助生殖技術(shù)中GV卵子成熟前老化發(fā)生在卵子沒(méi)有及時(shí)在適當(dāng)時(shí)間刺激成熟，卵子質(zhì)量就會(huì)下降，在重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)成熟前老化的卵母細(xì)胞的保護(hù)作用目前仍然未知。
　　因此，在本研究中，小鼠卵子用IBMX模擬

15、人類輔助生殖技術(shù)控制性促排卵中卵子成熟前老化，并用不同藥物培養(yǎng)不同的時(shí)間段，然后卵子進(jìn)行 IVM評(píng)估重金屬耦合劑和抗氧化劑在小鼠卵子細(xì)胞器中的作用。我們的研究中，GV期的小鼠卵子在含有IBMX的培養(yǎng)液中培養(yǎng)可以避免發(fā)生減數(shù)分裂，從而讓卵子維持在GV期，而添加重金屬耦合劑（EDTA），抗氧化劑（檸檬酸鈉、硫辛酸(ALA)和乙酰肉堿(ALCAR)），分別體外成熟前老化12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)，然后再把卵子體外成熟培養(yǎng)(IVM)。IVM后

16、，卵子通過(guò)生發(fā)泡破裂(GVBD)、減數(shù)分裂、線粒體活動(dòng)分布、紡錘體組裝和DNA碎片（DSBs）等指標(biāo)檢測(cè)來(lái)評(píng)估體外成熟前老化卵子的細(xì)胞質(zhì)量，為探索人類 ART周期中成熟前老化卵母細(xì)胞的低發(fā)育潛能和高損失率的機(jī)制提供新的思路，同時(shí)為治療 ART中由于卵子老化引起的胚胎發(fā)育不良等后果提供理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　因此，在本研究中，小鼠未成熟卵母細(xì)胞用IBMX使其在GV期分別停止發(fā)育12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)，模擬體內(nèi)卵子

17、成熟前老化狀態(tài)，體外培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)培養(yǎng)液中添加重金屬耦合劑EDTA和抗氧化劑檸檬酸鈉、硫辛酸ALA和乙酰肉堿 ALCAR，然后對(duì)體外老化的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，老化后的成熟卵母細(xì)胞通過(guò)GVBD率、MII率、線粒體活動(dòng)分布、紡錘體組裝等指標(biāo)檢測(cè)來(lái)評(píng)估體外成熟前老化卵子的細(xì)胞質(zhì)量，未能成熟的GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行DNA碎片（DSBs）檢查，從而評(píng)估重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)體外老化的小鼠卵母細(xì)胞是否有保護(hù)卵子免受氧化應(yīng)激損傷，提高卵子受精發(fā)育

18、能力的作用，在防止卵子老化和為高齡婦女等患者提供輔助生殖策略等方面均有重要的意義。
　　研究方法：
　　1.體外培養(yǎng)體系中加入重金屬耦合劑和抗氧化劑，對(duì)小鼠未成熟卵子進(jìn)行體外老化及體外成熟處理。
　　拾獲的小鼠未成熟卵母細(xì)胞分為五組：1)重金屬耦合劑組（MC）;2)抗氧化劑組(AO組);3)重金屬耦合劑和抗氧化劑組(MC+AO組);4)對(duì)照組(Control組)。5)新鮮組
　　1.1.實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行PMSG促排卵

19、。
　　1.2.GV期未成熟卵母細(xì)胞的收集。
　　1.3.新鮮組卵母細(xì)胞直接體外成熟培養(yǎng)。
　　1.4.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組卵母細(xì)胞分別體外成熟前老化12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)。
　　1.5.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組卵母細(xì)胞成熟前老化后移除 IBMX，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。
　　2.對(duì)新鮮組卵母細(xì)胞和不同老化時(shí)間的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟率和其他能量代謝指標(biāo)檢查。
　　2.1.GVBD率和MII率。
　　計(jì)算每個(gè)組核

20、膜破裂消失(GVBD)的卵子數(shù)量和第一極體卵子吐出(MII)成熟階段的卵子數(shù)量。
　　2.2.線粒體活動(dòng)分布。
　　Mitotracker Red CMXRos線粒體分布檢查
　　2.3.紡錘體形態(tài)及染色體排列。
　　采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行紡錘體和染色體檢查。
　　2.4.卵母細(xì)胞DNA損傷DSBs。
　　GV期停滯卵母細(xì)胞用DNA損傷探針γ-H2AX抗體進(jìn)行DSBs檢查。
　　研究結(jié)果：<

21、br>　　1.重金屬耦合劑和抗氧化劑提高老化卵子成熟率
　　小鼠未成熟卵子經(jīng)過(guò)體外成熟前老化12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)后再進(jìn)行IVM，14-16小時(shí)后計(jì)算其GVBD率和MII成熟率。當(dāng)卵子經(jīng)過(guò)成熟前老化12小時(shí)后，GVBD率和MII成熟率在四個(gè)組中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)成熟前老化延長(zhǎng)至24小時(shí)和36小時(shí)，卵子在重金屬耦合劑和抗氧化劑處理組和對(duì)照組在GVBD率中仍然沒(méi)有差異。隨著體外老化培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)，所有組中的卵母細(xì)胞的成熟率都有明

22、顯下降，然而，在24小時(shí)和36小時(shí)中在重金屬耦合劑和/或抗氧化劑組中卵母細(xì)胞達(dá)到MII期的比率明顯比對(duì)照組高（P＜0.05）。
　　2.重金屬耦合劑和抗氧化劑在線粒體分布中的作用和延遲線粒體凋亡。
　　線粒體分布及其功能對(duì)卵子成熟和進(jìn)一步發(fā)育有著重要影響。異常線粒體活性成簇狀/團(tuán)裝分布，我們的結(jié)果顯示，30.6％-47.5%的卵母細(xì)胞在12小時(shí)成熟前老化后呈現(xiàn)異常線粒體分布模式，而各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)24小

23、時(shí)-36小時(shí)成熟前老化后，我們?cè)贆z測(cè)其線粒體分布情況，重金屬耦合劑和/或抗氧化劑組中卵母細(xì)胞的異常線粒體分布明顯低于對(duì)照組。當(dāng)成熟前老化時(shí)間從12小時(shí)延長(zhǎng)到36小時(shí)，卵母細(xì)胞異常線粒體分布在所有組中都有升高（P＜0.05）。
　　3. EDTA、檸檬酸鈉、ALA和ALCAR維持老化卵子的正常紡錘體形態(tài)和染色體排列
　　卵子質(zhì)量同樣取決于正常紡錘體形態(tài)和染色體排列。異常紡錘體/和染色體排列的比例在對(duì)照組明顯高于重金屬耦合劑和/

24、或抗氧化劑處理組，重金屬耦合劑組卵母細(xì)胞的異常紡錘體/和染色體排列比率在12-36小時(shí)成熟前老化中都比對(duì)照組低（P＜0.05），抗氧化劑組和混合組在12小時(shí)和24小時(shí)成熟前老化中跟對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)差異，只有在36小時(shí)成熟前老化中才出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.重金屬耦合劑和抗氧化劑可以降低DNA損傷形成
　　ROS和抗氧化劑的不平衡可以導(dǎo)致不同形式的DNA損傷，DSBs是最嚴(yán)重的DNA損傷表現(xiàn)之一，嚴(yán)重威脅卵子的活

25、力甚至生命。我們發(fā)現(xiàn)，12小時(shí)成熟前老化中，DSBs平均熒光強(qiáng)度在抗氧化劑組明顯低于其他組，但其他組沒(méi)有差異，當(dāng)成熟前老化延長(zhǎng)至24小時(shí)，抗氧化劑組和混合組仍然維持低水平。24-36小時(shí)成熟前老化后混合組同樣顯示低水平。結(jié)果提示重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)于ROS形成的DNA損傷在長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)有保護(hù)作用，但抗氧化劑硫辛酸和乙酰肉堿比重金屬耦合劑的保護(hù)作用更強(qiáng)大。
　　總的來(lái)說(shuō)，我們發(fā)現(xiàn)，重金屬耦合劑和抗氧化劑在提高成熟率、保護(hù)線粒體

26、功能、紡錘體形態(tài)和DNA組裝方面可以有明顯抗氧化作用，從而保護(hù)卵子免受OS損傷。當(dāng)體外老化時(shí)間延長(zhǎng)到12-36小時(shí)，重金屬耦合劑和抗氧化劑的保護(hù)作用愈加明顯。線粒體功能損傷、異常紡錘體和DNA損傷可能與老化卵子的低發(fā)育率有關(guān)系。因此，沃恩的研究建議，重金屬耦合劑和抗氧化劑可以添加到培養(yǎng)液中以保護(hù)卵子免受氧化應(yīng)激損傷。
　　研究結(jié)論：
　　1、體外成熟前老化的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中其線粒體功能損傷、異常紡錘體發(fā)生和DNA損傷