阻斷磷脂酶C-γ1通路對腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤SWO細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是常見的神經(jīng)外胚層腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40％以上，臨床表現(xiàn)包括星形膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。由于其位置特殊且極易向周圍腦組織浸潤，惡性膠質(zhì)瘤成為臨床治療最為棘手的腫瘤之一。目前，治療膠質(zhì)瘤的方法主要為手術(shù)切除配合放、化療。但由于其浸潤性生長并對放、化療有一定的耐受性，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后通常很差。尋找能夠有效抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的方法成為近年來國內(nèi)外學(xué)者孜孜不倦追求的目標(biāo)。

2、 腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)是一種具有較強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子，由激活的單核巨噬細(xì)胞分泌。它具備多種生理活性，如控制細(xì)胞的增殖與分化，介導(dǎo)組織損傷的急性反應(yīng)，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子(如IL、IFN、TGF等)的分泌等等。最重要的是，它能引起腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死。其分子機(jī)制如下：TNF-α與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后，將一系列胞漿蛋白激活并募集到細(xì)胞膜內(nèi)表面，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(deathi

3、nducingsignalingcomplex，DISC)，從而激活caspase家族蛋白的級聯(lián)反應(yīng)，最終使蛋白降解，細(xì)胞凋亡。但研究發(fā)現(xiàn)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的許多惡性腫瘤對TNF-α并不敏感，這與TNF-α在細(xì)胞內(nèi)激活另一條抗凋亡通路有關(guān)，即TNF-α信號激活核因子-κB(NF-κB)，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)啟動某些抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。如何拮抗TNF-α啟動的抗凋亡信號，使腫瘤細(xì)胞對其更敏感，是近年來的研究熱點(diǎn)之一，也

4、是本課題主要探討的問題。 磷脂酶C-γ1(phospholipaseC-γ1，PLC-γ1)是肌醇磷脂特異的磷脂酶C家族中的一員，是連接生長因子受體酪氨酸激酶及其下游信號傳遞分子之間的主要橋梁。當(dāng)細(xì)胞膜表面的受體酪氨酸激酶被活化后，PLC-γ1的酪氨酸殘基被磷酸化而激活，繼而催化膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成甘油二脂(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。PLC-γ1所介導(dǎo)的信號通路主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、運(yùn)動等行為；它

5、是細(xì)胞中的存活分子，對某些條件下(如氧化應(yīng)激)細(xì)胞的生存非常重要。目前在許多惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了PLC-γ1的高表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，這提示PLC-γ1與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多研究表明，抑制PLC-γ1的活性，能降低腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附及侵襲能力。但PLC-γ1的高表達(dá)是否與腫瘤細(xì)胞的“不死”有關(guān)，是否參與腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控，PLC-γ1所介導(dǎo)的通路與TNF-α通路是否存在相互干擾，有關(guān)這方面的研究還

6、未見報(bào)道。 本課題以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SWO為模型，以TNF-α為誘導(dǎo)凋亡的因素，分別以化學(xué)阻斷劑U73122及慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾法阻斷PLC-γ1通路，研究PLC-γ1在TNF-α誘導(dǎo)SWO細(xì)胞凋亡中的作用。首先，我們用四唑鹽(MTT)比色法檢測SWO細(xì)胞對TNF-α的敏感性，發(fā)現(xiàn)SWO細(xì)胞對TNF-α非常不敏感，104U/L、105U/L、2×105U/L和5×105U/L的TNF-α作用48h對SWO細(xì)胞的增殖抑制率分別為

7、8.07％、5.18％、22.51％和26.28％；而以2.5μmol/LU73122預(yù)處理細(xì)胞后給予上述濃度TNF-α刺激，細(xì)胞增殖抑制率分別為27.43％、29.07％、29.72％和22.04％；以5μmol/LU73122預(yù)處理細(xì)胞后給予上述濃度TNF-α刺激，細(xì)胞增殖抑制率分別為28.74％、25.89％、23.95％和21.99％?？梢姡?.5μmol/L及5μmol/L的U73122能使較低濃度TNF-α(104U/L和1

8、05U/L)對SWO細(xì)胞的增殖抑制率大大增高，而對較高濃度的TNF-α(2×105U/L和5×105U/L)無明顯影響。接著，我們采用PI單染流式細(xì)胞儀檢測、DAN片段化分析及Caspase-3前體檢測的方法研究抑制PLC-γ1及給予TNF-α刺激對SWO細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示2.5μmol/LU73122或104U/LTNF-α單獨(dú)使用都不會引起細(xì)胞凋亡，但二者聯(lián)用卻能使SWO細(xì)胞發(fā)生凋亡，這說明PLC-γ1的抑制劑U73122能增

9、加SWO細(xì)胞對較低劑量TNF-α的敏感性，即PLC-γ1在TNF-α誘導(dǎo)的SWO細(xì)胞凋亡中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。為了進(jìn)一步探討其中的分子機(jī)制，我們采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾法特異性敲低SWO細(xì)胞PLC-γ1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)亦隨之下調(diào)，說明Bcl-2是PLC-γ1參與凋亡負(fù)調(diào)控的下游效應(yīng)分子之一。 本課題首次研究了PLC-γ1在TNF-α誘導(dǎo)的SWO膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中的作用，對進(jìn)一步深入認(rèn)識PLC-γ1與腫瘤細(xì)胞凋亡的