阻斷磷脂酶C-γ1信號通路對大腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其信號機(jī)制初步探討.pdf

1、大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，死亡率位居惡性腫瘤死亡譜的第4或第5位。然而，大腸癌治療效果卻不盡理想，約有半數(shù)患者治療失敗。因此，如何有效地干預(yù)、阻斷大腸癌的發(fā)生發(fā)展就成為亟待解決的問題。其中，尋找大腸癌的發(fā)病環(huán)節(jié)與靶點(diǎn)是研究的一個(gè)主要方面。蛋白質(zhì)及相關(guān)的信號通路異常與大腸癌的發(fā)生有著重要關(guān)系，表現(xiàn)為一些與細(xì)胞生長、分裂和增殖有關(guān)的信號傳導(dǎo)通路處于異?；罨癄顟B(tài)，而一些凋亡通路則往往傳遞信號受阻。大腸癌發(fā)生中信號傳導(dǎo)通路的研究不僅為大腸癌發(fā)

2、病機(jī)制的研究拓寬了視野，同時(shí)也為大腸癌的治療提供了更多的靶點(diǎn)選擇。 磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)是肌醇磷脂特異的磷脂酶C(PLC)家族中的一員，是跨膜信號傳導(dǎo)中關(guān)鍵和重要的一個(gè)信號中介。在受激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生長因子等的受體或其它分子激活后催化水解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成兩個(gè)重要的第二信使二?；视?DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，分別激活蛋白激酶C(PKC)及引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，從而啟動下游一系列級聯(lián)反應(yīng)，在分泌、

3、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長及分化等一系列細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用。關(guān)于PLC-γ1在細(xì)胞增殖中的作用有兩種截然不同的認(rèn)識，在有些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校l(fā)現(xiàn)它是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂與增殖的一個(gè)重要的分子，依賴其磷脂酶活性通過DAG的生成、激活蛋白激酶C(PKC)，進(jìn)而活化ERK信號通路，或通過核轉(zhuǎn)位進(jìn)而激活核內(nèi)PI3K信號途徑這兩方面促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖；在另外一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袆t發(fā)現(xiàn)PLC-γ1對于細(xì)胞的分裂、增殖并不起作用。PLC-γ1也是一個(gè)重要的凋亡負(fù)調(diào)控分

4、子，對于許多情況下細(xì)胞的存活是必需的。PLC-γ1與大腸癌的發(fā)生也有著重要關(guān)系，與正常組織相比，腺瘤和結(jié)腸癌組織中的PLC-γ1表達(dá)水平明顯增高，同時(shí)伴隨著其酶活性的升高，PLC-γ1與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生有著重要聯(lián)系，對腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也有重要影響。熱休克蛋白70(HSP70)是熱休克蛋白家族的一員，是一種重要的分子伴侶，在細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的調(diào)控中同樣發(fā)揮重要作用，在大腸癌中也呈高表達(dá)狀態(tài)。大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的PLC-γ1是否與

5、其過度增殖狀態(tài)和凋亡失活狀態(tài)有關(guān)系?阻斷PLC-γ1信號通路能否抑制大腸癌細(xì)胞的過度增殖和啟動大腸癌細(xì)胞的凋亡?HSP70和PLC-γ1信號系統(tǒng)是否有聯(lián)系，對大腸癌細(xì)胞增殖和凋亡有何影響?目前尚未有研究回答這些問題。 本課題以大腸癌LOVO細(xì)胞株為研究模型，通過阻斷PLC-γ1信號通路，研究其對大腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并初步探討這些影響的可能信號機(jī)制，從而為研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供細(xì)胞與分子生物學(xué)依據(jù)。根

6、據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模疚牡膶?shí)驗(yàn)可分為以下兩個(gè)部分： 一、阻斷PLC-γ1信號通路對大腸癌LOVO細(xì)胞增殖、生長特性的影響及信號機(jī)制初步探討 方法：以人大腸癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞作為研究模型，利用化學(xué)阻斷劑U73122阻斷LOVO細(xì)胞的PLC-γ1信號通路后，從以下幾個(gè)方面研究阻斷PLC-γ1信號通路后對LOVO細(xì)胞的影響：1.對LOVO細(xì)胞增殖的影響：作常規(guī)生長曲線，MTT法測定其細(xì)胞增殖抑制率；2.對LOVO細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)行的影

7、響：流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期各時(shí)相的細(xì)胞比例；3.對LOVO細(xì)胞生長特性的影響：光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，集落形成實(shí)驗(yàn)；4.對LOVO細(xì)胞中熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響：免疫印跡(Westernblot)檢測HSP70的表達(dá)水平。 結(jié)果：1.阻斷PLC-γ1信號通路能大大降低LOVO細(xì)胞的貼壁能力，表現(xiàn)在光鏡下圓形細(xì)胞增多，而貼壁良好的梭形細(xì)胞減少，掃描電鏡下細(xì)胞的突起變短變細(xì)，細(xì)胞表面的微絨毛減少；2.PL

8、C-γ1信號通路被阻斷后使得LOVO細(xì)胞的增殖速度減慢，細(xì)胞增殖抑制明顯，并且表現(xiàn)出濃度依賴性，10μmol/LU73122作用24、48h后其抑制效果可分別達(dá)到35％和45％；3.阻斷PLC-γ1信號通路降低了LOVO細(xì)胞的集落形成能力，1μmol/LU73122作用即能使LOVO細(xì)胞的集落形成數(shù)減少一半左右，10μmol/LU73122作用時(shí)，則幾乎沒有細(xì)胞集落的形成；4.阻斷PLC-γ1信號通路能增加LOVO細(xì)胞G1期細(xì)胞比例，降

9、低S期細(xì)胞比例，從而抑制其細(xì)胞周期的進(jìn)行；5.阻斷PLC-γ1信號通路后，LOVO細(xì)胞中的熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)水平明顯增高。 討論：研究發(fā)現(xiàn)阻斷PLC-γ1信號通路后能夠抑制LOVO細(xì)胞的過度增殖，說明PLC-γ1是維持大腸癌細(xì)胞過度增殖的一個(gè)重要分子，也支持了PLC-γ1在細(xì)胞增殖調(diào)控中的重要作用。我們認(rèn)為阻斷PLC-γ1信號通路能夠抑制大腸癌細(xì)胞的過度增殖應(yīng)該和其本身過度表達(dá)PLC-γ1有關(guān)，對于同樣過度表達(dá)P

10、LC-γ1的乳腺癌等其它腫瘤細(xì)胞的增殖，我們推測PLC-γ1可能發(fā)揮同樣重要的作用。LOVO細(xì)胞PLC-γ1信號通路被阻斷后其G1期細(xì)胞比例降低而S期細(xì)胞比例增加，說明這種細(xì)胞增殖被抑制的機(jī)制之一是使LOVO細(xì)胞受阻于G1期，延緩細(xì)胞從G1期向S期的過渡，即通過抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行而實(shí)現(xiàn)。阻斷PLC-γ1信號通路后LOVO細(xì)胞中HSP70表達(dá)增加，說明有可能通過HSP70的分子伴侶作用與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)行的某些關(guān)鍵分子結(jié)合，穩(wěn)定其構(gòu)象，激活

11、或抑制它們的活性，從而抑制LOVO細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)行。通過抑制異?；罨男盘柾穪碇委煷竽c癌的策略具有良好的應(yīng)用前景。我們推測PLC-γ1有希望成為大腸癌治療中的一個(gè)新的靶點(diǎn)。 二、阻斷PLC-γ1信號通路對大腸癌LOVO細(xì)胞凋亡的影響方法：以人大腸癌細(xì)胞株LOVO細(xì)胞作為研究模型，利用化學(xué)阻斷劑U73122阻斷LOVO細(xì)胞的PLC-γ1信號通路后，從以下幾個(gè)方面研究阻斷PLC-γ1信號通路后對LOVO細(xì)胞凋亡的影響：1.光學(xué)顯

12、微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；2.瓊脂糖凝膠電泳分析；3.PI單染的流式細(xì)胞儀檢測；4.凋亡執(zhí)行蛋白Capspase-3檢測：免疫印跡(Westernblot)。 結(jié)果：阻斷PLC-γ1信號通路后發(fā)現(xiàn)1.雖然多數(shù)LOVO細(xì)胞鏡下表現(xiàn)圓形樣改變，但并未見凋亡特征性的皺縮樣變，同時(shí)臺盼藍(lán)染色檢測沒有發(fā)現(xiàn)死亡細(xì)胞增多，細(xì)胞活力沒有改變；2.瓊脂糖凝膠電泳未檢測到凋亡特征性的DNA片斷化梯狀帶；3.PI單染的流式細(xì)胞儀檢測也未有凋亡特征性的亞二

13、倍體峰的出現(xiàn)；4.免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)Caspase-3的前體表達(dá)量沒有變化，即沒有Caspase-3的激活。 討論：阻斷PLC-γ1信號通路后，未檢測到凋亡特征性的形態(tài)和生化特征的變化，同時(shí)也未有凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活，說明阻斷PLC-γ1信號通路不能啟動大腸癌細(xì)胞凋亡，PLC-γ1不是調(diào)控大腸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號分子。我們推測阻斷PLC-γ1信號通路不能啟動大腸癌細(xì)胞凋亡的可能原因是其它信號通路的代償活化，比如HS

14、P70表達(dá)增加的抗凋亡效應(yīng)。阻斷PLC-γ1信號通路有可能降低大腸癌細(xì)胞的抗凋亡能力。 結(jié)論：一、阻斷PLC-γ1信號通路能夠抑制大腸癌LOVO細(xì)胞的過度增殖、改變其生長特性，這種細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制之一是使LOVO細(xì)胞受阻于G1期，延緩細(xì)胞從G1期向S期的過渡即抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行而實(shí)現(xiàn)；阻斷PLC-γ1信號通路可上調(diào)HSP70的表達(dá)水平，HSP70的分子伴侶作用可能是其抑制大腸癌細(xì)胞周期進(jìn)行的機(jī)制；PLC-γ1和HSP70都是調(diào)

15、控大腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)行的重要分子，HSP70可能是PLC-γ1信號途徑的下游信號分子。 二、阻斷PLC-γ1信號通路不能夠啟動大腸癌細(xì)胞的凋亡，PLC-γ1不是調(diào)控大腸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號分子，HSP70的表達(dá)增高對于維持大腸癌細(xì)胞的凋亡抑制狀態(tài)可能有一定作用。 大腸癌發(fā)生發(fā)展中涉及許多信號傳導(dǎo)通路的異常，大腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的失控是許多信號通路交互作用的結(jié)果，PLC-γ1信號通路與這些異常的信號通路之間到底有何